植物甜蛋白brazzein基因的克隆与表达.pdf

植物甜蛋白B r a z z e i n基因的克隆与表达 摘 要 植物甜蛋白是指自 然界中存在的具有甜味或可以引起甜味产生的蛋白 质， 迄今为止 已发现了7 种，包括嗦吗甜 ( T h a u m a t i n ) 、莫奈林 ( M o n e l l i n ) 、马槟榔 ( M a b i n l i n )、 神秘果素( Mi r a c u l i n ) 、 喷塔汀( P e n t a d i n ) 、 库克灵( C u r c u l i n ) 及布拉齐因 ( B r a z z e i n ) 甜蛋白作为一种天然非糖类的甜味剂，具有高甜味、低热卡、无毒、安全、多功能等优 点， 有很高的营养价值、应用价值和经济价值 B r a z z e in 是从热带植物P e n t a d ip la n d r a b r a z z e a n a B a i l l o n的 果实中 分离得到的 甜蛋 白 它是由5 4个氨基酸组成的小分子量单链蛋白 ， 分子量为6 . 5 k D a， 富 含赖氨酸 丁 鸣等[[ I ] 研究了B r a z z e i n 的 特性 和化学 修 饰， 发 现B r a z z e i n 含有8 个C y s ， 形 成了 分子内 的4 对二硫键，溶液等电点为5 , B r a z z e i n的甜度是等质量蔗糖的2 0 0 0倍。

与其它植 物甜蛋白 相比， B r a z z e i n的分子量最小，它具有良 好的 水溶性， 其结构相对简单， 并具有 良 好的 热 稳定性 和p H稳定 性 ， 它在8 5℃ 仍 保持 折 叠 形式 ， 在8 0℃ 保持4 h甜 度 没有 减 弱， 在高p H值的溶液中仍保持甜味活性 迄今为止对B r a z z e i n 的一级结构和二级结构以及甜味机理研究比较充分， 对于应用 上的研究比较少 为了获得大量纯度高的、 具有生物学活性的B r a z z e i n 蛋白以满足基础 研究与工农业应用的需要，本文将B r a z z e i n 基因与P E T系列原核表达载体进行了重组， 在大肠杆菌B L 2 1 ( D E 3 )中初步进行了 表达方面的实验研究 1 根据大肠杆菌偏爱的密码子，利用P C R技术体外人工合成B r a z z e i n c D N A序列， 将其连入克隆载体T - e a s y 中， 测序结果分析表明扩增的片段为目 的 基因 2 . 设计一对特异性P C R引物， 导入适当限制性内 切酶切点， 以上述连有目的基因的 克隆载体为模板，采用P C R方法扩增基因 片段， 获得长度约1 8 0 饰的B r a z z e i n 基因 序 列。

3 . 将B r a z z e i n 基因 进行 双酶切 后， 连入 原核 表 达 载体p E T - 3 2 a ( + ) 和p E T 3 0 a ( + ) 中 ， 构建原核 表达重组 质 粒p E T - 3 2 a ( + ) - B r a z z e i n 和p E T 3 0 a ( + ) - B r a z z e i n o 测 序 验 证表 达载体 构建正确后，以B L 2 1 ( D E 3 )作为宿主菌，进行融合表达研究 4 . S D S - P A G E 分析表明， 重组质 粒p E T 3 2 a ( +) - B r a z z e i n 在I P T G 诱 导 下 表达分 子量 约2 b k D a 的融合蛋白， 约为菌体总 蛋白 的2 0 % 左右; 重组质粒p E T 3 0 a ( + ) - B r a z z e i n在 I P T G诱导下表达分子量约 1 2 k D a的重组蛋白，融合蛋白 表达量约占 菌体蛋白总量的 2 5 % . 5 .菌体采用溶菌酶裂解，融合蛋白以包涵体形式存在 关键词: 甜蛋白;B r a z z e i n ;基因克隆:基因表达 C l o n i n g a n d Ex p r e s s l n g Ab s t r a c t o f Br a z z e i n [ 'h e r e a r e s e v e n k n o w n s w e e t - t a s t i n g p r o t e i n s : T h a u m a t i n , Mo n e l l i n , Ma b i n l i n , Mi r a c u l i n , P e n t a d i n , C u r c u l i n a n d B r a z z e i n .T h e y h a v e a d v a n t a g e o u s p r o p e r t i e s o f b e i n g n o n t o x i c , l o w c a l o r i c a n d n o n c a r i o g e n i c . S o t h e y h a v e t h e p r o b a b i l i t y t o t a k e p l a c e o f s u g a r . T h e s e p r o t e i n s c a n e l i c i t s w e e t t a s t e t h o u g h t h e i r s t r u c t u r e a r e d i f f e r e n t fro m e a c h o t h e r . B r a z z e i n o r i g i n a l l y s e p a r a t e d f r o m t h e f r u i t o f t h e A f r i c a n p l a n t P e n t o d ip l a n d r a b r a z z e a n a B a i l l o n . B r a z z e i n i s a 6 . 5 k D a p r o t e i n w i t h f o u r d i s u l f i d e b o n d s . B r a z z e i n h a s b e e n s e q u e n c e d , i t i s a s i n g l e c h a i n p r o t e i n . I t i s t h e s m a l l e s t , m o s t h e a t s t a b l e a n d p H s t a b l e s w e e t p r o t e i n k n o w n t o d a t e . T h e r e a r e t w o f o r m s o f B r a z z e in : t h e m a j o r f o r m ( 5 4 a m i n o a c i d s ) a n d t h e m i n o r f o r m ( 5 3 a m i n o a c i d s ) . T h e t w o f o r m s a r e i d e n t i c a l e x c e p t f o r a b s e n c e o f a p y r o g l u t a m i c a c i d a t t h e a mi n o t e r mi n u s o f t h e mi n o r f o r m. B r a z z e i n g e n e s w e r e t r a n s f o r m e d i n t o E .c o l i t o s t u d y t h e s t r u c t u r e a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p . B u t t h e r e a r e n o f u r th e r e x a c t r e p o r t s a b o u t t h e a p p l i e d s t u d y o f B r a z z e i n . I n o r d e r t o g e t s u f f i c i e n t q u a n t i t i e s o f p u r e b i o l o g i c a l l y a c t i v e B r a z z e i n t o m e e t t h e n e e d o f b a s i c r e s e a r c h a n d c l i n i c a l u s e , w e c l o n e d t h e g e n e o f B r a z z e in i n t o p E T p l a s m i d s , a s e r i e s o f p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r , a n d e x p r e s s e d t h e r e c o m b i n a n t p l a s m i d s i n t h e E .c o l i o f B L 2 1 ( D E 3 ) . 1 . B r a z z e i n g e n e w e r e c l o n e d饰 w a y o f P C R , t h e n l i g a t e d t h e g e n e s o f B r a z z e i n t o t h e v e c t o r o f T - e a s y , t h e r e s u lt s o f s e q u e n c i n g i n d i c a t e t h a t t h e s e q u e n c e s o f B r a z z e i n a r e c o r r e c t . 2 .B r a z z e i n g e n e w e r e a c h i e v e d b y P C R u s i n g a p a i r o f o l i g o - n u c l e o t i d e p r i m e r s t o i n t r o d u c e t o t h e s u it a b l e r e s t r i c t i o n e n z y m e s i t e , a n d t h e B r a z z e i n p r o d u c t o f P C R c o n t a i n s 1 8 0 b a s e p a i r s . 3 . T h e g e n e o f B r a z z e i n w e r e l i g a t e d i n t o t h e e x p r e s s i o n v e c t o r p E T 3 2 a ( + ) a n d p E T 3 0 a ( + ) a ft e r c u t b y t h e r e s t r i c t i o n e n z y m e s . We t r a n s f e r e d t h e r e c o m b i n a n t v e c t o r p E T3 2 a ( + ) - B r a z z e i n a n d p E T3 0 a ( + ) - B r a z z e i n i n t o t h e E . c o l i o f B L 2 1 ( D E 3 ) a ft e r e n c o d i n g fr a g m e。