《保健食品用菌种致病性评价程序》201948.docx

附件2保健食品用菌种致病性评价程序（征求意见稿）1 范围 本程序规定了保健食品生产用菌种（包括细菌、丝状真菌和 酵母）的致病性评价程序本程序规定了作为保健食品的活性成分（活菌）和作为保健 食品生产发酵用菌株两类微生物的致病性评价本程序适应于保健食品申请审批时对生产用菌种的致病性 评价，对用拟评价菌种生产的产品中其他成分的评价，应参照国 家相关规定进行本程序不适应于基因修饰微生物的致病性评价2术语和定义2.1 致病性，Pathogenicity 微生物感染宿主造成健康损害引起疾病的能力2.2 产毒能力， Toxigenicity 微生物产生对人和动物有毒作用的活性代谢产物的能力2.3 毒性， Toxicity 微生物有毒代谢产物引起的宿主健康损伤3拟评价微生物菌种的基本要求3.1 基本信息菌种名称（包括学名、俗名、拉丁名等）、来源及用途3.2 菌种分类学资料 提供由有菌种鉴定资质的检验机构出具的对拟评价菌种规 范、科学的分类学（属、种、株名称或株号）资料细菌的分类 和命名应遵循原核生物系统学国际委员会（ International Committee on Systematics of Prokaryotes ）的规定，并符合 原核生物国际命名法规（Int erna tional Code of Nomencla ture of Prokaryotes）要求。

真菌的分类和命名应遵循国际藻类、真 菌和植物命名法规（International Code of Nomenclature for algae, fungi, and pla nts） 进行3.3 菌种鉴定资料 根据目前已有的知识，提供基于表型或最新基因测序技术确切鉴定到种水平的资料3.4 菌种生长环境条件资料 提供菌种生长最适培养基及培养条件（培养时间、培养温度和湿度、光照等），以及菌种保藏及复壮方法等3.5 诱变菌种 经诱变的菌种还需提供详细的诱变方法（包括使用的诱变剂诱变条件及诱变实验流程等）3.6 生产相关信息 包括但不限于安全用于保健食品工业生产的记录、工艺流程企业标准等资料3.7 其他国家审批资料提供其他国家批准拟评价菌种作为保健食品或普通食品生产使用的资料；3.8 其他需要说明的信息4 评价方法4.1 国内外安全性评价资料综述基于国内外文献数据，提供拟评价菌种的国内外使用历史、 安全性评价资料，包括其致病性和产毒能力的报告、科技文献或 综述等；若无拟评价菌种的上述资料，应提供同种内其他菌株或 与其相近种属的安全性评价资料4.2 全基因组测序(Whole Genome Sequencing, WGS)4.2.1基因测序对拟评价菌株进行全基因组测序，提供包括但不限于以下信 息：-DNA 提取方法- 测序方案及仪器设备- 序列组装方法- 序列质量评价-FASTA 文件- 与预期基因组大小相关的 contigs 总长度- 基因注释流程- 对真菌而言，还需提供从相关数据库中获得的注释质量信 息。

4.2.2 基因序列分析将拟评价菌株的基因组序列与已有的数据库(包括但不限于VFDB、PAI DB、MvirDB、CGE 等）最新版本中存储的序列进行比 对，并分析拟评价菌种遗传物质中与致病相关的已知毒力因子、 毒素代谢基因的存在情况至少提供包括以下信息的分析报告：- 毒力（或产毒相关）基因名称、所在位置、与最新数据库 中已有毒力基因的匹配度等信息- 编码的蛋白及序列号- 毒力因子（毒素产生、侵袭和粘附因子等）- 同源百分比和 e 值- 数据库中已充分描述过的菌株名称- 基因组图谱- 拟评价的真菌菌种还应根据文献报道能够产生的毒素类 别，针对性检索是否存在毒素合成关键基因4.3 动物致病性试验由有菌种致病性检测和评价资质的机构，按照附录 A、B 和 C 实验方案进行保健食品用拟评价细菌、真菌、酵母菌种对动物 的致病性实验、评价并出具报告4.4 产毒实验对某些能够产生真菌毒素的真菌，应在多种基质（单品种固 体、多品种固体复合、不同成分液体组合等）中进行产毒实验， 并按照国家标准检测方法或国际组织/相关国家规定的标准检测 方法进行有毒活性代谢产物含量检测根据到目前为止我国已批准可用于保健食品的真菌名单，用 于保健食品生产用的红曲霉属应进行桔青霉素产毒实验。

5结果判定5.1 出现以下结果一个以上者，则认为菌株的致病风险较低，可 作为保健食品生产用菌种5.1.1三个以上国家批准作为食品或保健食品用菌种且具有长期 （30 年以上）的使用历史5.1.2全基因序列分析结果显示不存在已知的毒力相关基因或毒 素合成关键基因；5.1.3 动物实验显示无致病性，5.1.4 产毒实验结果显示在受试的基质中均不产生有毒活性代谢 产物5.2 出现以下结果之一者，则认为具有致病风险，不能作为保健 食品生产用菌种5.2.1根据现有知识，全基因序列分析发现存在已知毒力基因（或 毒素合成关键基因）；5.2.2 动物试验结果显示有致病性；5.2.3 产毒实验显示在受试的任何一种基质中可产生有毒活性代谢产物5.3 其他需要综合判断的情况5.3.1 全基因序列中发现存在已知毒力基因（或毒素合成关键基 因），但动物实验显示不具有致病性，或产毒实验未检测到已知 的有毒活性代谢产物；5.3.2 全基因测序列中未发现存在已知的毒力基因（或毒素合成 关键基因），但动物实验显示具有致病性，产毒实验未检测到已 知的有毒活性代谢产物；出现上述情况之一者，需结合国内外使用历史和安全性评价 资料、国内外文献综述、生产工艺、生产条件、终产品中生产菌 种的存在情况等进行综合判断。

附录A（规范性附录）保健食品用细菌致病性试验方法1 范围本方法规定了保健食品用细菌的致病性试验方法本方法适用于保健食品用细菌的致病性评价2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 恒温培养箱：36 0C±1 OCO2.2 电子天平：感量 0.1 g2.3 锥形瓶：容量 500 mLO2.4 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL刻度）、10 mL （具0.1 mL刻 度）2.5 无菌试管：16X160 mmo2.6 显微镜：10X〜100X2.7 微量移液器及枪头： 1.0 mL2.8 注射器： 1.0 mL2.9 小鼠灌胃针头2.10 厌氧培养装置：厌氧罐、厌氧箱2.11 Class II 生物安全柜3 培养基和试剂3.1 0.85%无菌生理盐水：商品化的生理盐水，或 8.5gNaCl 溶于lOOOmL生流水中，12『C髙压灭菌15 min，备用3.2 LB 肉汤培养基：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配 制，充分加热溶解后分装，121C髙压灭菌15 min,制备LB肉 汤培养基，备用3.3 LB琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书配用蒸馏水制， 充分加热溶解后分装，121C髙压灭菌15 min，制备LB琼脂平 板，备用。

3.4 MRS 肉汤培养基：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水 配制，充分加热溶解后分装，121C髙压灭菌15 min，制备MRS 肉汤培养基，备用3.5 MRS 琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水配 制，充分加热溶解后分装，121C髙压灭菌15 min，制备MRS琼 脂平板，备用3.6 双歧杆菌琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水 配制，充分加热溶解后分装，121C髙压灭菌15 min，制备双歧 杆菌琼脂平板，备用4 实验动物选用昆明或ICR健康小鼠，雌雄各半，体重18.0g〜22.0 g5 操作步骤所有拟评价的菌株均必须进行腹腔注射和经口灌胃两种途 径染毒动物，评价菌株对动物的致病性5.1 腹腔注射5.1.1 菌种活化与菌悬液制备到目前为止我国批准的可用于保健食品的细菌菌种主要是 双歧杆菌和乳杆菌，新的申报菌种在以下描述中归为其他细菌根据菌种的培养特征，将双歧杆菌和乳杆菌接种 MRS 肉汤、 其它细菌接种LB肉汤，并置适宜的培养条件下（包括培养温度、 湿度，厌氧、需氧、微需氧等）培养一定时间后，将双歧杆菌接 种MRS琼脂平板或双歧杆菌琼脂平板，乳杆菌接种MRS琼脂平板， 其他细菌接种 LB 琼脂平板，培养一定时间后，刮取平板上的菌 落，将其悬浮于无菌生理盐水中，充分混匀后，用适量无菌生理 盐水调整菌悬液浓度，用比浊法使菌悬液中菌体细胞的最终浓度 不低于 5.0X107 CFU/mL。

5.1.2 腹腔注射小鼠 40只，雌雄各半，分别随机分成4组（每组10 只），包 括雄性小鼠菌悬液灭活对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠菌 悬液灭活对照组、雌性小鼠菌悬液组每只小鼠注射 0.2 mL， 使每只小鼠注射菌量至少107 CFU/只5. 1. 3动物观察动物腹腔注射后每天观察 1次，至少观察 21 d观察动物出现下列（但不限于）异常的情况：（1）皮肤和毛； （2）眼睛和粘膜；（3）呼吸系统；（4）肢体活动；（5）行为方 式；（6）特别注意观察出现振颤、抽搐、腹泻、嗜睡、流涎和昏 迷等现象；（7）体重：注射前及注射后每周所有小鼠称量，并测 量实验期间死亡的、最终处死的小鼠体重若小鼠的存活时间超 过Id,记录其体重变化；（8）尽可能精确记录小鼠的死亡时间5.2 经口灌胃5.2.1 菌种活化与菌悬液制备除制备菌悬液浓度不小于2.5X108 CFU/mL外，其他操作 步骤同 5.1.15.2.2 灌胃小鼠 40只，雌雄各半，分别随机分成4组（每组10 只），包 括雄性小鼠菌悬液灭活对照组、雄性小鼠菌悬液组、雌性小鼠菌 悬液灭活对照组、雌性小鼠菌悬液组，分别以2.0 mL/100g・BW 的剂量给小鼠灌胃，灌胃前应禁食一夜，灌胃后3〜4h喂食。

5.2.3 观察同5.1.3 6 结果与报告对5.1和5.2的实验结果进行统计学分析，并进行评价，包括：（1） 拟评价菌株对动物体重的影响是否有统计学意义；（2） 动物出现异常特征的时间及症状描述、出现异常的动 物数目等，包括每只动物的死亡时间；3) 受试物组动物在实验期间未出现中毒症状或死亡，且 对其生长发育等影响无统计学意义，即可判定该菌种无 致病性；受试物组动物在试验期间出现中毒症状或死亡 或试验期间影响其生长发育，即可判定该菌种具有致病 性附录B（规范性附录）保健食品用丝状真菌的致病性试验方法1 范围本方法规定了保健食品用丝状真菌的致病性试验方法本方法适用于保健食品用丝状真菌的致病性评价2 设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：2.1 培养箱：28 0C±1 OCO2.2 电子天平：感量 0.1 g2.3 锥形瓶：容量 500 mLO2.4 无菌吸管：1 mL （具0.01 mL刻度）、10 mL （具0.1 mL刻 度）2.5 显微镜：10X〜100X2.6 微量移液器及枪头： 1.0 mL2.8 比浊仪2.9 注射器： 1.0 mL2.10 小鼠灌胃针头。

2.11 接种针2.11 Class II 生物安全柜3 培养基和试剂3.1 麦芽汁琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用蒸馏水 配制，充分加热溶解后分装，1211髙压灭菌15 min，制备麦芽 汁琼脂平板，备用3.2 马铃薯葡萄糖琼脂平板：商品化培养基按照产品说明书用 蒸馏水配制。