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酶的分离纯化摘要：酶的分离纯化有很多的方法，在纯化的工艺上有很多的不同，不同来源的 酶在分离纯化中表现出不同的洗脱特性在具体实验中的酶浓度、饱和度和适用 的分离方法都不同酶的分离纯化工作主要是将酶从杂蛋白中分离出来或者将杂 蛋白从酶溶液中除去现有酶的分离纯化方法都是依据酶和杂蛋白在性质上的差 异而建立的关键词：分离；酶；纯化；方法前言：酶的分离纯化工作，是酶学研究的基础酶的纯化过程，就目前而言，还 是一门实验科学一个特定酶的提纯往往需要通过许多次小实验进行摸索，没有 通用的规律可循酶的纯化过程与一般的蛋白质纯化过程和比，乂有其本身独有 的特点：一是特定的一种酶在细胞中的含量很少，二是酶可以通过测定活力的方 法加以跟踪，前者给纯化带来了困难，而后者却能使我们迅速找出纯化过程的关 键所在］的分离与幺屯化^的概^令1酶的分离与纯化是指将晶从细胞或其他含酶材料中提取出来，再与杂质分开，从 而获得符合使用目的、有一定纯度和浓度的酶制剂的过程2酶的分离纯化2.1酶的提取⑵把酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，即将尽可能多的酶，尽量 少的杂质从原料中引入溶液2.2生物组织的破碎⑶各种生物组织的细胞有着不同的特点，在考虑破碎方法时，要根据细胞性质、处 理量及酶的性质，采用合适的方法。

1) 机械(匀浆)法利用机械力的搅拌、剪切、研碎细胞常用的有高速组织捣碎机，高压匀浆泵、 玻璃或Teflon加研棒匀浆器高速球磨机或直接用研钵研磨等2) 超声波法超声波是破碎细胞或细胞器的一种有效手段经过足够时间的超声波处理，细菌 和酵母细胞都能得到很好的破碎超声处理的主要问题是超声空穴局部过热引起 酶活性丧失，所以超声振荡处理的时间应尽可能短，容器周围以冰浴冷却处理， 尽量减小热效应引起的酶的失活3) 冻融法生物组织经冰冻后，细胞胞液结成冰晶，使细胞壁胀破冻融法所需设备简单， 普通家用冰箱的冷冻室即可进行冻融一般需在冻融液中加入蛋白酶抑制剂，如 PMSF(苯甲基磺酰氟)、络合剂EDTA、还原剂DTT (二硫苏糖醇)等以防破坏日的 酶4) 渗透压法渗透破碎是破碎细胞最温和的方法之一细胞在低渗溶液中由于渗透压的作用， 溶胀破碎如红血球在纯水中会发生破壁溶血现象但这种方法对具有坚韧的多 糖细胞壁的细胞，如植物、细菌和霉菌不太适用，除非用其他方法先除去这些细 胞外层坚韧的细胞壁5) 酶消化法利用溶菌酶、蛋白水解酶、糖昔酶对细胞膜或细胞壁的酶解作用，使细胞崩解破 碎将革兰氏阳性菌(如枯草杆菌)与溶菌酶一起温育，就能得到易破碎的原生 质体，用EDTA与革兰氏阴性菌(如大肠杆菌)-•起温育，也可制得相应的原生 质体。

儿丁质酶和3—葡聚糖酶则常用于水解曲霉、面包霉等的细胞壁6) 化学破碎法化学破碎法是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构改变或破坏的方 法2. 3提取方法e(1) 盐溶液提取大多数酶溶于水，而且在一•定浓度的盐存在条件下，酶的溶解度增加，这称之为 盐溶现象，然而酶浓度不能太高，否则溶解度反而降低，出现盐析现象所以一 般采用稀盐溶液进行酶的提取，盐浓度一般控制在0. 02^0. 5 mol/L的范围内 例如，用固体发酵生产的联曲中的a 一淀粉酶、糖化酶、蛋白酶等胞外酶，用 0. 15 mol/L的氯化钠溶液或0.020.05 mol/L的磷酸缓冲液提取；酵母醇脱氢 酶用0. 5、0. 6 mol/L的磷酸氢二钠溶液提取；6 —磷酸葡萄糖脱氢酶用0. 1 mol/L 的碳酸钠提取：枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1 mol/L的氯化镁提取等有少数酶， 如霉菌产生的脂肪酶，用清水提取比盐溶液提取的效果较好如：采用(阳4) 2S04分段盐析、透析、阴离子交换柱层析氐2) 酸溶液提取有些酶在酸性条件下溶解度较大且稳定性较好宜用酸溶液提取例如从胰脏中提 取胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶，采用0.12 mol/L的硫酸溶液进行提取。

3) 碱溶液提取有些在碱性条件下溶解度较大且稳定性较好的酶，应采用碱溶液提取例如，细 菌L一天门冬酰胺酶的提取是将含酶菌体悬浮在pH 1广12.5的碱溶液中，振荡 20 min,即达到显著的提取效果4) 有机溶剂提取有些与脂质结合比较牢固或分子中含非极性基团较多的酶，不溶或难溶于水、稀 峻、稀碱和稀盐溶液中，需用有机溶剂提取常用的有机溶剂是与水能够混溶的 乙醇、内酮、丁醇等其中丁醇对脂蛋白的解离能力较强，提取效果较好，已成 功地用于琥珀酸脱氢酶、细胞色素氧化酶、胆碱酯酶等的提取如：豆壳氧化物酶液经硫酸铉-内酮协同沉淀，内酮分级沉淀，最后用硫酸锌除 杂⑹2. 3. 1酶的纯化［7：抽提的酶液是否需要进一步经过纯化，要视其应用部门的要求一般工业的酶， 如纺织工业应用a —淀粉酶脱胶处理，往往采用液体粗酶便可；皮革工业应用的 细菌蛋白酶也是如此食品工业应用的酶如果粗酶液已达到食品级标准要求，特 别是卫生指标，也无需进一•步纯化然而，应用于医药、化学试剂级的酶液必须 进一步纯化2. 3.2酶分离纯化的方法选择⑻(1) 根据分子大小、轻重的差异而建立的分离方法有离心法、筛膜分离法、凝胶过滤法等(2) 根据溶解度大小不同而建立的分离方法有盐析法、有机溶剂法、共沉淀法、 选择性沉淀法、等电点沉淀法等。

3) 根据分子所带电荷正负及多少的差异而建立的分离方法有离子交换层析法、 电泳分离法、聚集层析法等，如：运用离子层析技术对酶分离纯化；运用电泳等 技术研究理化特性⑼4) 根据分子稳定性差异而建立的分离方法有选择性热变性法、选择性酸碱变 性法等5；根据分子亲和作用的差异而建立的分离方法有亲和层析法、亲和电泳法等 采用Sephadex G 1 0 0和Sephadex G 5 0柱层析法纯化该 酶，以纤维蛋白平板法测定该酶的纤溶活性皿6)在某些情况可以选择多种方法并用如:采用盐析、Sephacryls-2001R凝胶过 滤层析、DEAE SephacryE. E离子交换层析结合的方法分别建立了来源于费氏内 酸杆菌谢氏亚种和植物乳酸杆菌的亚油酸异构酶的分离提取步骤商3影响酶分离纯化的因素3. 1基本原理在显微镜下，可观察到凝胶过滤层析介质具有海绵状结构将凝胶装于层析柱中, 加入混合液，内含不同分子量的物质叩，小分子溶质能在凝胶海绵状网格内，即 凝胶内部空间全都能为小分子溶质所达到，凝胶内外小分子溶质浓度一致在向 下移动的过程中，它从一个凝胶颗粒内部扩散到胶粒孔隙后再进入另一•凝胶颗 粒，如此不断地进人与流出，使流程增长，移动速率慢故最后流出层析柱。

而中 等大小的分子，它们也能在凝胶颗粒内外分布，部分送入凝胶颗粒，从而在大分 子与小分子物质之间被洗脱大分子溶质不能透人凝胶内，而只能沿着凝胶颗粒 间隙流运动，因此流程短，下移速度较小分子溶质快而首先流出层析柱因而样 品通过定距离的层析柱后，不同大小的分子将按先后顺序依次流出，彼此分开3OOooo0QOOOOOeooooooooooooooooooQ^Q图凝胶过滤层析的原理小分子由于扩散作用进入凝胶内部被截留；大分子被排阻在颗粒外，在颗粒间迅 速通过D蛋白质混合物上柱(2) 洗脱开始，小分子扩散进入凝胶颗粒内大分子被排阻在颗粒外(3) 小分子被截留，大分子向下移动，大小分子分开(4) 大小分子完全分开(5) 大分子行程较短，已洗脱出层析柱,小分子尚在行进中3.2凝胶种类3.2.1葡聚糖凝胶是分子量几万到几十万的葡聚糖凝胶通过环氧氯丙烷交联而 成的网状结构物质,可分离分子量从1 000、500 000的分子其商品名是Sephadex G,有各种型号(表2 — 3 ), G后的数字表示每g干胶吸水量(即吸水值)的10 倍其特性如表2-3所示，另外还有一种为Sephacryl—S,通过N, N一甲叉双 丙烯酰胺交联的烯内基葡聚糖，可适用于水、有机溶剂及高浓度解高试剂存在的 系统。

另一类Sephadex-LH,适用于脂类化合物的分离葡聚糖凝胶在干燥状态是坚硬的白色粉末，不溶于水和盐类溶液因具有大量的 羟基，故有很大的亲水性，在水中即显膨胀，吸水后机械强度大大降低它对碱 和弱酸(pH 2~12)稳定在强酸溶液中，特别是在高温度下，糖昔键会水解 在中性下，可在120 C加压消毒保存和氧化剂接触会分解长久不用时，有 时会长霉，应加防腐剂3. 2.2聚内烯酰胺凝胶是以丙烯酰胺为单体，通过N , N 一甲叉双丙烯酰胺为交 联剂共聚而成的凝胶物质商品名是Bio -Gel P ,有各种型号，P —后的数 字乘以1 000表示其分离的最大分子量(即排阻分子量)o3.2.3琼脂糖凝胶，琼脂糖是琼脂抽去琼脂胶等之后所得D 一半乳糖和3 , 6 — 脱水半乳糖，自动缔合而成的网眼结构物质，孔径大小由胶的浓度决定以商品 Sepharose为例，有2B、4B和6B等规格，B前面数字表示胶百分浓度这类 凝胶孔径都比较大,适于分离较大的物质，如病毒、细胞颗粒和DNA等4酶的分离纯化新技术在生产111的应用4. 1三种方法(1) 组织提取：木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶(2) 微生物发酵：最大量的来源(3) 化学及生物合成：生物重组4. 2高新技术的应用：(1) 酶的修饰(2) 固定化(3) 基因重组(4) 膜分离技术(5) 冷冻干燥(6) 微胶囊4. 4集中垄断，市场全球化：(D规模企业由20世纪80年代初的80多家减少至20多家，占市场90%⑵丹麦诺和诺得公司(诺维信novozymes) 一 1978年进入中国诺维信公司，占 50%市场(天津)；(3) 美国杰能科公司(Genencor) —98年进入中国，与无锡合资，控股80% (无 锡)，两家公司销售额占全球2/3； (2005年杰能科国际公司被丹尼斯克公司收 购)；(4) 芬兰科特公司和丹麦丹尼斯克公司酶制剂业务合并,Pfizer, Rhone, SKW , Biosystems,日本天野4.5品种、规模不断扩大(1) 目前30多家600多个品种，应用于18个工业领域。

2) 我国2000年酶制剂产量为30万吨，100家，市场份额仅占5%,以未经除菌 去渣的粗制品粉状酶为主3) 国际以液体、颗粒为主4) 国内糖化酶、a-淀粉酶、蛋白酶三大类占了 97%,显然不合理5) 重要产品普鲁兰酶、真菌淀粉酶、系列果胶酶、低温碱性蛋白酶，国内尚未 投入生产；(6) 我国春7家上市公司介入酶制剂开发生产4.6应用领域不断扩大：美国酶制剂年产值6. 25亿美元，食品工业占62%,拓展饲料工业、洗涤剂工业、 化学工业结论：酶经分离、纯化后要确定该纯化步骤是否适宜，必须经过对有关参数的测 定及计算才能确定酶的产量是以活力单位表示，因此在整个分离过程中每一步 始终贯穿比活力和总活力的检测、比较酶活力(Enzyme activity):酶活力是指酶催化反应的能力，它表示样品中酶的 含量1961年国际酶学会规定1 min催化1 P mol分子底物转化的酶量为该酶的 一个活力单位(国际单位)，温度为25C,其它条件(pH、离子强度)采用最适条 件参考文献：[1] 郭勇.酶工程.第2版.北京：科学出版社，2004.[2] 徐风彩.酶工程.北京：中国农业出版社，2001.[3] 罗贵民.酶工程.北京:化学工业出版社,2002.[4] 施巧琴.前工程.北京:科学出版社,2005.[5] 康平.汗.秋宽.宋琳琳.徐玲.皱纹。