第七组 从蛋清中提取溶菌酶并分离纯化的实验方案.docx

W勒壬回苹再耳奉旌毒：曹场 爭殊書土&轴塑鼻毘戢里 铝畏瞬粋逖私号从蛋清中提取溶菌酶并分离纯化【实验目的】1. 掌握离子层析分离纯化溶菌酶的原理以及离子交换层析的操作方法2. 理解SDS-聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)测定蛋白质纯度与分子量的原理3. 掌握电泳原理以及SDS-PAGE垂直板电泳分离蛋白质技术 【实验原理】溶菌酶( lysozyme )是由弗莱明在192 2年发现的，它是一种有效的抗菌 剂，全称为1,4-B-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶 活性中心为天冬氨酸和谷氨酸，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-52 35乙酰氨基葡萄糖(NAG)与“-乙酰胞壁酸(NAM)间的B-1, 4糖苷键，相对分 子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基， 所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50°C,最适PH为6〜7左右在280nm 的消光系数［A1Cm ］为13.0该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+ (10-5〜 10-3M)以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+ (10-5〜10M)、NaCl所激活。

溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为 2%〜4%)和哺乳动 物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用 于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用鸡蛋的蛋清中含有丰富的上述物质，本文实验以鸡蛋蛋清为原料，对溶菌酶 进行提取并分离纯化溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性 ，在中性条件下溶菌酶带 正电荷，因此在分离制备时，先采用等电点法粗分离，再用DE-52纤维素离子交 换色谱和葡聚糖G50凝胶层析分离纯化，最后用SDS-PAGE鉴定材料与仪器】鸡蛋3个DE-52纤维素 葡聚糖G500.5*7cm 色谱柱、2.5*20cm 色谱柱、烧杯(100ml,250mL, 1000mL)、锥形瓶 (100ml)、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、纱布、量筒(100mL,250 mL, 1000mL)、 10 mL离心管、1.5mL Ep管、高速离心机、冰箱、SDS-PAGE电泳设备、电炉【试剂配制】1. 40%甘油2. 冰醋酸3. 5mol/L NaOH4. 20%磺基水杨酸溶液5. TEMED溶液,4°C保存6. 10%过硫酸铵（AP）：称取过硫酸铵（NH4）2S2O8lg，溶于10mL蒸馏水 中。

临用前配制）7. 2XSDS 上样缓冲液：0.1mol/L Tris-Hcl （pH6.8）、4%SDS、20%甘油、0. 2%溴酚蓝，4%B—巯基乙醇，4C保存8. 30%丙烯酰胺贮存液：称取29.2g丙稀酰胺、0.8g N,N'-甲叉双丙稀酰 胺，加少量蒸馏水溶解后定容至100mL过滤，4C保存9. 分离胶缓冲液（1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液）：取 18.2g Tris，加少量蒸馏水溶解用1mol/L盐酸调节pH至8.8（约48ml）后,定容至100mL10. 浓缩胶缓冲液（0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液）：取 6.0g Tris，加少量蒸馏水溶解用1mol/L盐酸调节pH至6.8（约48mL）后,定容至100mL11. 4%浓缩胶（10mL）： 0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 2.5mL，胶贮液 1.3mL, 10%SDS 100ul，TEMED 10ul，10%AP 100ul，双蒸水 6.1mL12. 12%分离胶（20mL）： 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 5mL，胶贮液 8mL，10%SDS 200ul，TEMED 8ul，10%AP 200ul，双蒸水 6.6mL。

13. pH8.3 Tris-Gly 电泳缓冲液:Tris 6 g、glycine 28.8 g、SDS 1 g，加少 量蒸馏水溶解，pH调至8.3，定容至1 L14. 考马斯亮蓝染色液：1.25g考马斯亮蓝R250、450mL甲醇：水（1： 1） 50mL冰醋酸15. 脱色液：450mL甲醇：水（1： 1）、50mL冰醋酸16. 0.02 mol/L PBS（ pH8.0）:取 5.3mL 0.2M NaH2PO4 溶液，94.7mL 0.2M Na2HPO4溶液，加蒸馏水稀释至1000 mL,混匀【实验步骤】1.溶菌酶的粗提取（约两个半小时）拿3个鸡蛋破壳取蛋清置于250mL烧杯中，轻轻搅拌5分钟，使其的稠度均匀，然后用两层纱布过滤，去除脐带和蛋壳记录其体积V1加入1.5倍体积的pH8.0 PBS缓冲液，搅拌均匀用冰醋酸调PH4.7左右，充分搅拌3500rpm，离心 20min弃沉淀，转移上清至烧杯中加入1倍体积的pH8.0 PBS缓冲液，搅拌均匀，并用5mol/L NaOH调pH8.0滤纸过滤，取清液，测量并记录体积V2取0.5mL清液并加入等量甘油于1.5mL Ep管中，制备2管，-20°C备用余下的清液分装在10mL离心管中-20C冻存备用。

样品S1）2. 溶菌酶的分离纯化（ 1 ） DE-52 初次纯化溶菌酶① DE-52 纤维素的处理a. 用0.5mol/LHCl洗涤：称取5克DE-52纤维素置于250ml烧杯中，加入 75ml0.5mol/LHCl溶液，搅拌混匀数分钟，静置半小时后，加水100ml,用玻璃 棒搅拌，静置10分钟，倾去上层悬浮的细颗粒重复加水、静置、倾去上层悬 浮细颗粒等步骤2~3次，用蒸馏水洗至流出液PH24b. 用0. 5mol/L NaOH洗涤：加入0.5mol/L NaOH溶液75ml，静置半小时, 加蒸馏水100ml,搅拌后倾去上层液，用蒸馏水洗至流出液PHW8② 装柱色谱柱垂直装好，加入缓冲液赶走柱中气泡；关紧出口，把准备好的DE-52纤 维素悬浮液边搅拌边用滴管加入柱内，打开出口，让其沉降，柱床沉体积 13cm 高，床面盖少量缓冲液，并投入一小圆形滤纸，以隔开凝胶床面，再用缓冲液平 衡③ 加样、洗脱当柱床尚残留缓冲液约1 2mm时，加入样品S1 15滴左右，当样品全部进入柱 床后，先吸取磷酸盐缓冲液约3~4滴冲洗，然后再加入缓冲液冲洗，用20%磺基 水杨酸检测流出液有无蛋白质，用1.5mL管收集4~5滴蛋白质溶液。

收集完后, 紧接着用20%磺基水杨酸检测之后的液体中有无蛋白质）样品S2）（ 2）葡聚糖 G50 再次纯化溶菌酶① 凝胶的处理 商品凝胶是干燥的颗粒，使用前需在水中溶胀，溶胀必须彻底，否则会影响色谱 的均一性故在实验前先称取5克葡聚糖G50于烧杯中加入5~10倍水，让其自 然溶胀24小时以上，经这样处理的凝胶才能准备装柱② 装柱用0.02 mol/L pH8.0 PBS溶液将凝胶调成稀薄的浆状液，盛于烧杯中，然后在 轻微地搅拌下使凝胶缓慢地沉降于柱内，松开流出口夹子，让其自然沉降，凝胶 加至沉体积约占柱长的2/3为止，盖上一小圆形滤纸，以防加样时冲散凝胶表面， 夹住流出口的橡皮管③ 加样、洗脱当柱床顶部的0.02 mol/L pH8.0 PBS溶液（洗脱液）尚残留少许时，缓慢加入 样品S2，松开流出口夹子，当样品全部进入柱后，可先加入少量洗脱液冲洗粘 附在柱壁上的样品，然后再加洗脱液洗脱，用20%磺基水杨酸检测流出液中有无 蛋白质，以及时收集含蛋白质的洗出液3. 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定（1）蛋白样品的处理取200UL上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入200UL的2X上样缓 冲液，混匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100°C沸水浴 中加热3〜5min，取出后10000r/min离心10min，取上清待用。

① 电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好试样格（梳子）临用 前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干② 按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水, 静置30分钟凝胶配制过程要迅速，催化剂TEMED要在注胶前再加入，否则 凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡水封的目的是为了使 分离胶上延平直，并排除气泡凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的 界面③ 倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶，连续平稳加入浓缩胶 至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置样梳需一次平稳插入，梳口处不得 有气泡，梳底需水平④ 拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖要使 锯齿孔内的气泡全部排出，否则会影响加样效果.）⑤ 加样，从第一个开始按已编排好的顺序依次加入蛋白Marker和相应体积的样 品其中Marker和样品加样量均为20吐微量移液器不可过低，以防刺破 胶体，也不可过高，在样下沉时会发生扩散为避免边缘效应，最好选用中部 的孔注样⑥ 电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电流恒定在20mA，当进入 分离胶后改为30mA，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。

⑦ 凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切 下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42°C染色40min 左右剥胶时要小心，保持胶完好无损，染色要充分⑧ 脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰⑨ 将凝胶扫描分析，求出溶菌酶的相对分子质量注意事项】1. 等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀；2. 调节pH时要避免局部过酸；3. 提取过程中尽量避免泡沫的产生4. 加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样体积小于柱体积的1/35. 在整个实验过程中，流速必须得到一定的控制过大，会使填料压缩紧 密，导致流速过低，层析柱有可能堵塞而实验失败，流速过小，实验时间过长， 引起酶的活性变化对于CM Sepharose FF填料，最适流速在100cm/h以下因 此，在我们的实验中，控制流速为2mL/min6. 冲平过程一定不能省因为在上样过程中，还有未挂柱的蛋白未能从色 谱柱中完全流出，因此需先用缓冲液对整个色谱柱进行冲平，以便使未结合或结 合不紧密的杂蛋白流出，以免干扰洗脱7. N,N'-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应 避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。

但其凝固后就变成无毒物质8．安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏9．用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过10．加样时样品不能超出凹形样品槽加样槽中不能有气泡，如有气泡，可 用注射器针头挑除参考文献】[1] 李蓉,陈国亮.高效阳离子交换色谱法分离纯化蛋清中的溶菌酶 .色谱,2002,20(3):259-261.[2] 张文会,王艳辉,马润宇. 离子交换法提取鸡蛋清溶菌酶. 食品工业科技, 2003,23(6):57-59.[3] J.萨姆布鲁克等著•黄培堂等译.2002分子克隆实验指南•第3版•北京：科学出版社[4] 张维铭 主编.2003.现代分子生物学实验手册.第1版.北京：科学出版社[5] 林亲录，马美湖，金阳海，秦丹，胡亚平. 鸡蛋卵清中溶菌酶的提取与纯。