玉米不育突变体生殖器官蛋白质SDSPAGE初步分析.doc

中国农业大学学士学位论文 毕 业 论 文论文题目 玉米不育突变体生殖器官 蛋白质SDS-PAGE初步分析学 院 农学与生物技术学院 专业年级 植物遗传育种042班 姓名学号 李进伟 040108905 指导教师 康定明 职 称 教授 （2008年 06 月）中国农业大学教务处制- 17 -中国农业大学学士学位论文 摘 要细胞质雄性不育在杂种优势利用中起着重要作用 ,从蛋白质水平探讨细胞质雄性不育发生的机理具有重要的理论和实践意义本实验计划用差异蛋白质组学的方法研究一个新发现的玉米细胞质雄性不育材料CMS-P及其对应保持系生殖器官蛋白质组学的差异，以期在蛋白质组学水平上找到这个新型玉米细胞质雄性不育突变体在性器官发育上引起不育的蛋白质组学差异。

论文对其不育系和保持系生殖器官等组织分别进行蛋白质SDS-PAGE电泳初步分析，初步尝试确定玉米雄性不育系和保持系之间体内蛋白质表达的种类和数量差异结果发现两系生殖器官组织间存在较多差异表达蛋白带,种子间仅有少量差异表达蛋白带,而苗期叶片间基本没有差异表达蛋白带 ,说明影响育性发育的相关蛋白表达具有时空性和器官特异性 ,与育性有关的蛋白主要在生殖器官中表达关键词：玉米， 细胞质雄性不育， CMS-P， 差异蛋白质组学AbstractMale Sterile Cytoplasm plays an important role in the production of hybrid seeds .The knowledge of the mechanism of the CMS from protein is essential to hybrid seed production.Using the method of the differential proteomics, the experiment studies the proteomics of the reproductive organs of the CMS-P and its maintainer line，in order to find the proteomics differences that induced male sterile on sexual organs development of this CMS-P. By SDS-PAGE, analyzing on the reproductive organs and other tissues of the sterile line and the maintainer line, the experiment determines differences of the proteins expressed species and quantity between these .It was indicated that the expression of the male sterile genes was spatial and periodical, and the reproductive organs were the major organ in which the proteins related to the male sterility were expressed. Key words: Maize, CMS, CMS-P, Differential Proteomics中国农业大学学士学位论文 目录目 录摘 要 2Abstract 3第一章 前言 51.1玉米雄性不育 51.2 玉米细胞质雄性不育 51.2.1 玉米细胞质雄性不育的种类 51.2.2 细胞质雄性不育的育性恢复 51.2.3 细胞质雄性不育的分子研究 61.3蛋白质组学 61.3.1差异蛋白质组学的研究 71.3.2差异蛋白质组学的应用 71.4 选题的目的和意义 8第二章 玉米CMS和保持系生殖器官及其他组织蛋白质组比较 92.1 材料与方法 92.1.1材料准备 92.1.2实验方法 92.2 结果与分析 112.2.1 玉米CMS与相应保持系叶片蛋白质组比较 112.2.2 玉米CMS与相应保持系生殖器官蛋白质组比较 132.2.3玉米CMS与相应保持系籽粒蛋白提取法比较 15第三章 讨论 17参考文献 18致 谢 19中国农业大学学士学位论文 第一章 前言第一章 前言1.1玉米雄性不育植物雄性不育在植物界普遍存在，是指植物体不能产生有活力的正常花粉的现象，表现为雄蕊缺失、畸形、雄性器官雌性化、花药不能正常开裂、小孢子发生异常、形成无活力的花粉或不能形成花粉等多种形式，但雌性器官发育正常，可接受正常花粉而受精结实的现象。

雄性不育本是不利于物种繁衍的有害变异，但在作物育种工作中，由于它可以免去繁杂的人工去雄工作，能在设计的特定田间试验中产生大量杂交种，因而在杂种优势利用和群体改良中具有很高的价值，是遗传研究和育种应用中的宝贵资源雄性不育植株作为育性基因的突变体，它又是进行雄蕊和花粉发育研究，育性基因表达调控研究以及雌雄异株植物起源与进化研究的极好材料因此，探讨植物雄性不育发生的机理对生产实践和基础理论研究都有重要意义雄性不育在遗传上可以分为由细胞核基因控制的核雄性不育（GMS）和细胞质与细胞核基因互作控制的细胞质雄性不育（CMS）两种类型玉米上已发现了60个核不育基因，大多数是隐性，与细胞胞质不育比较，细胞核不育有3个优点：1）育性稳定，基本属于无花粉型；2）育性正常的自交系都是其恢复系，不育基因可以转移到任何核背景中，实现杂交组合的自由组配；3）不存在因细胞质单一化而导致病原菌小种转化感染的危险但是，细胞核雄性不育利用的最大困难是无稳定的保持系，所以没有在生产上推开1.2 玉米细胞质雄性不育1.2.1 玉米细胞质雄性不育的种类Rhoads于1931年首例报道了玉米细胞质雄性不育Beckett（1971）将玉米细胞质雄性不育划分为C组、S组、T组，同一组别内测交后代的育性反应以及对小斑病T小种的测交抗性反应十分接近，又据扬州大学生物工程实验室的报道，又发现一种不同于上述三种组别的胞质不育类型，定名为YⅡ-1型。

因此目前的玉米胞质不育可划分为四个类型，根据线粒体DNA酶切图谱分析，将C群划分为三个亚群，即CⅠCⅡCⅢ徐尚忠等（2001）对C、T、S三种雄性不育组别进行了线粒体DNA的RFLP分析，结果发现在COXII/BamHI探针/酶组合下，正常胞质在6.0Kb有一条带,T组不育胞质则在5Kb 有一条带,从而说明了这三种不同胞质不育类型在mtDNA的RFLP图谱上的不同反应1.2.2 细胞质雄性不育的育性恢复CMS在遗传上呈母性遗传，表明遗传控制因子位于细胞质内，但不育性可以被细胞核中的恢复基因恢复在CMS细胞质的线粒体基因组中发现受核恢复基因调控的ORF、URF阅读框及嵌合基因，显示出胞质雄性不育与线粒体存在密切关系不育的核基因MS与不育胞质S相互作用产生不育性，育性恢复基因Rf特异的与S胞质相互作用则导致雄性可育，Rf基因没有鉴别出来之前，雄性不育系常被认为是细胞质类型的，随着Rf基因的发现和鉴别，这种不育类型实际上是一种核质互作现象He S等（1995）在对菜豆的研究中发现；使花粉恢复育性的2个核基因fr1和fr2是通过不同机理实现育性恢复的，fr2抑制与育性不育有关的mtDNA中的PVS序列的表达，而fr1是通过删除PVS序列使得花粉恢复育性的。

Dewey R C等（1986）在玉米CMS-T胞质雄性不育线粒体DNA中存在一个turf-13基因，它编码一种13Kda多肽UFR13，这个多肽与雄性不育有关，两个恢复基因Rf1、Rf2可以恢复其育性，当有Rf1存在时，这种多肽积累降低80%Rf2虽然并不影响URF的积累，但Rf2可能与能量代谢，以及与URF的相互作用有关Wise R P等（1999）发现水稻CMS-BT中含有一个B-apt16基因，它编码一种2kb的RNA，在有恢复基因存在的情况下，这段RNA加工成两个片断，其一上1.5kb这个1.5kb的RNA片断能翻译出一个正常的多肽，因而导致不育就目前研究来看，CMS胞质和核背景基因型的互作来影响育性或育性的恢复主要有以下几个方面，诱导mtDNA结构变化，引起CMS恢复可育；在转录水平上调控线粒体基因表达；影响CMS对环境的敏感性和败育过程因此核育性恢复基因可能是通过调控与CMS有关的mtDNA片断的表达或删除与CMS有关的转录活跃的mtDNA片断使得育性得以恢复，但核育性恢复基因是否和其他核基因一起协调作用来使得育性恢复这一问题还有待研究1.2.3 细胞质雄性不育的分子研究对CMS的分子水平的研究大致有两个方面，核酸和蛋白质。

一切生命现象最终由蛋白质来体现，人们对雄性不育系与可育系DNA比较得到的差异也应在其翻译产物中体现出来1978年，Forde首先在玉米胞质雄性不育性的研究中使用了蛋白质离体翻译技术，他从T-CMS线粒体离体翻译产物中发现了一条13kDa的多肽，推断该多肽与玉米T型胞质雄性不育性有关之后Loving等对合成13kDa特异多肽的基因进行了研究，发现T-CMS玉米的mtDNA中有一个特异3547bp片断，推测这一嵌合片断是基因间分子重组的结果Loving等同样应用离体翻译技术证明了13kDa多肽为T-CMS玉米所特有Forde的后继研究证实T-CMS确实合成了特异13kDa的多肽，与之相比，正常可育株则特异的合成一种21kDa的多肽，这在以往结果中没有检测到恢复系线粒体离体翻译产物与T-CMS相比，13kDa多肽的合成量受到明显抑制这再次证实了13kDa的多肽与不育性有关由此可见，离体翻译技术采用灵敏度高，独立得到细胞器表达产物，为CMS机理研究提供了更可靠、更直接的实验证据1.3蛋白质组学蛋白质组学是由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年首次提出的，指的是某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质。

它和蛋白质化学有所不同，强调全面性和整体性，能够获得体系内所有蛋白质组分的物理、化学及生物学参数，如相对分子质量、等电点、表达量和胞内定位等活细胞的生命状态会受许多因素的影响而发生改变，细胞内蛋白质在质和量上的变化是产生这种现象的重要原因目前不管是在基因组水平或是转录水平上得到的结果，都不足以对这种变化进行准确的描述采用蛋白质组分析方法，不但可以确定在导致这种变化的过程中，究竟有哪些蛋白质在表达、其表达量如何。