osmpk3即tey型水稻c组mapk、磷酸化与e-box元素结合的转录因子水稻osbhlh65..doc

OsMPK3即TEY型水稻C组MAPK、磷酸化与E-box元素结合的转录因子水稻OsbHLH65摘要主要信息 OsMPK3是一种TEY型水稻C组MAPK，它直接在细胞核内磷酸化OsbHLH65OsMPK3和OsbHLH65在生物胁迫下被诱导表达，同时还可以抵抗相关激素摘要 MAPKs参与大部分的信号通路，如通过目标分子的磷酸化调节植物生长和抗逆性根据活性环中的TXY（X=E或D）模体，植物MAPKs被分为两个亚型，即TEY和TDY；TDY结构域是植物MAPKs所独有的在水稻中，17个MAPKs被分为6组到目前为止，TDY型的水稻MAPKs的功能已经清楚，但是，TEY型水稻C组MAPKs和它们可能的目标底物所知甚少在本研究中，我们认为TEY型水稻MAPK属于C小群，命名为OsMAPK3，它在细胞核中磷酸化其底物OsbHLH5我们的电泳迁移率改变分析结果表明：OsbHLH65特异结合E-box的顺式元件而不是G-boxOsMPK3和OsbHLH65都是被诱导治疗稻瘟病、稻褐飞虱和防御相关激素，如茉莉酸甲酯和水杨酸我们的研究结果表明：OsMPK3通过磷酸化bHLH转录因子促进防御信号转导。

关键词 水稻 稻瘟病菌 MAPK bHLH 生物胁迫 E-box顺式元件缩略词MAPK(MPK) 促丝裂原活化蛋白激酶BPH 稻褐飞虱ERK 胞外信号调节激酶CD 常见停靠位点TF 转录因子MAPKsbHLH 基本螺旋-环-螺旋前言MAPKs在胞内信号转导中扮演关键角色MAPK级联顺序包括3个蛋白激酶，即MAPKKK、MAPKK和MAPK（Ichimura et al.2002）根据活性环中TXT（X=E或D）模体类型，植物MAPKs分为两个亚型，而且它们都可以被MAPKK磷酸化TEY模体类似于动物ERK型MAPKs，但是TDY是植物特有的（Cristina et al.2010;Do’czi et al.2012;Hamel et al.2006）从藻类到高等植物，这两个模体都是高度保守的根据序列的相似性和蛋白质结构，拟南芥MAPKs被分为4组，A-D（Ichimura et al.2002），然而在水稻中已经确定有17个基因编码MAPKs被分为6组，A-F（Reyna and Yang 2006;Rohila and Yang 2007）在水稻中，A、B、C组MAPK有一个TEY模体和一个MAPKK的CD。

相比之下，D、E、F组MAPKs缺少CD，其活性环有一个TDY模体（Reyna and Yang 2006）TDY型MAPKs在活性环附近有3-4个氨基酸插入很多TDY型水稻MAPKs的功能已经清楚，但是对C组MAPK知之甚少（Liu and Xue 2007;Pires and Dolan 2010;Rohila and Yang 2007）无论在动物还是植物基因组中，TFs中的bHLH结构域都是高度保守的bHLH结构域是由50-60个氨基酸组成，形成两个不同的片段，一个基本片段是由10-15个氨基酸组成，一个HLH通过一个可变环将两个两亲螺旋分开（Carretero-Paulet et al.2010）DNA结合域位于bHLH的N-端两个bHLH蛋白的两亲螺旋可以相互绑定形成同源或异源二聚体总共167个和162个bHLH编码基因分别在水稻和拟南芥中被确定（Carretero-Paulet et al.2010），曾有报道bHLHs参与植物防御反应两个拟南芥bHLH TFs MYC3和MYC4需要JA调控生理过程，包括根系生长、抑制和抵抗病原体和昆虫（Ferna’ndez-Calvo et al.2011）。

在水稻中，WRKY和基本亮氨酸拉链（bZIP）TFs已确定作为MAPKs的目标分子，但是bHLH的类似信息仍然缺乏（Singh et al.2012）最近，据报道：水稻bHLH TF、RAI1被A组MAPKs磷酸化，如OsMAPK5和OsMAPK6（Reyna and Yang 2006），同时可以调节诱导子应答基因PAL1和WRKY19对抗稻瘟病（Kim et al.2012）然而，bHLH TFs家族相对较大，多个目标底物被水稻MAPKs磷酸化，在防御反应中这些目标底物被活化小粒野生稻很早就有研究（Cho et al. 2005；Shim et al. 2004），它抗褐飞虱和稻瘟病我们一个水稻MAPK，命名为OsMAPK3，与OmMPK同族在本研究中，我们筛选它可能的底物OsbHLH65，使用酵母双杂筛选系统鉴定该转录因子是否被OsMPK3磷酸化，我们也研究与OsbHLH65作用的顺式作用元件，用以分析在响应稻瘟病及褐飞虱和防御相关激素（如MeJA和SA）时OsMAPK3和OsbHLH65基因的表达材料与方法植物材料和病原菌处理水稻变种：华城幼苗25℃生长，光周期：16 h光照培养、8 h黑暗培养。

致病的KJ101和不致病的KJ301用于水稻稻瘟病接种我们大量喷射分生孢子悬浮液于生长4周的幼苗水稻褐飞虱侵染参考Shim et al（2004）我们将褐飞虱幼虫放置于生长4周的幼苗上，每次10 s激素处理水稻变种的无菌种子：韩国华城种子在湿滤纸的培养皿25°C 1周在黑暗条件下发芽之后，转移到组织细胞培养基上，其中有四层纱布(5×5厘米)和45mLMS培养基，25°C条件下，以光照培养16h黑暗培养8h为光周期培养2周幼苗根系三个不同的植物激素分别处理，即：茉莉酸甲酯、乙烯利、水杨酸，其使用浓度分别是100、500、200µMOsMAPK3和OsbHLH65的克隆以分别被稻褐飞虱和稻瘟病处理的水稻叶片为材料提取总RNA，混合后反转录成cDNA,以cDNA为模板PCR扩增得到全长OsMPK3和OsbHLH65.PCR产物克隆到pGEM-T简单载体(Promega)构建克隆表达重组蛋白,用SmaI酶切OsMPK3、EcoRI和XbaI 双酶切OsbHLH65分别多克隆到pGEX4T-3和pMAL-c2X然后转化到大肠杆菌BL21菌株内根据说明书分别用谷胱甘肽琼脂糖和直链淀粉树脂制备OsMPK3-GST和Osb HLH65-MBP融合蛋白。

体外活性测定用4个反应缓冲液进行活性测定(20 mM HEPES, 10 mM MnCl2or MgCl2, 1 mM Na2-VO4, 0.5 mM PMSF, 2 mM EDTA, 2 mM DTT, 200 nMATP, 1µCi [ɣ32]-P-ATP) ，将缓冲液和纯化的OsMPK3-GST和Osb HLH65-MBP融合蛋白各1ug用15uL反应体系反应髓磷脂碱性蛋白作为阳性对照使用10mMMn2+ 或者Mg2+测试金属离子辅助因子偏好性反应混合物30°C孵育30分钟，通过添加十二烷基硫酸钠(SDS)样品缓冲(250 mM Tris-Cl pH 6.8,10% SDS、30%甘油、0.02% 间溴苯芬蓝色)终止反应立即95°C煮沸5分钟然后10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶用考马斯亮蓝R - 250染色、晒干然后使用富士胶片bas - 2500图像分析系统进行放射自显影双分子荧光互补分析为构建BiFC分析克隆载体、OsMPK3和OsbHLH cDNA分别被克隆在pUC-SPYNE载体的Spe I/ XhoI位点和pUC-SPYCE载体的Spe I/ SmaI位点(Walter et al . 2004年)。

每1ug载体样品混合成同等体积氦启动粒子输送系统(pds - 1000 / HeTM;Bio-Rad)使用1100 psi的防爆膜和1.0 um黄金微载体导入洋葱表皮细胞然后样本MS固体培养基上25°C在黑暗培养12 h用DAPI(4 6-diamino-2-phenylindole)孵育洋葱表皮细胞5分钟给细胞核染色(1ug mL-1 DAPI的磷酸缓冲盐)BX51荧光显微镜下观察荧光反转录聚合酶链式反应和q RT - PCR分析使用TRI试剂提取总RNA，根据说明书以用低聚糖(dT)为引物用Super Script III反转录酶将5ug总RNA反转录成cDNA，RT- PCR分析,OsMPK3和OsbHLH65使用24个周期 EF1a作为内参基因使用22个周期RT- PCR条件是95°C 3min、22 - 24 个循环、95°C30s、57°C20s、72°C30s实时PCR,根据说明书以Light Cycler 480 SYBR Green I控制系统实时定量PCR循环程序包括95°C 10分钟激活初始聚合酶，其次95°C10s、58 °C10s、72°C20s、40个循环每个循环的72°C延伸后用Mono Hydrolysis Probe setting (483–533 nm)检测荧光。

用Light Cycler480 定量软件中的倒数最大法分析数据每个cDNA样品扩增的时候做3个重复，为使其标准化用水稻EF1α作为内参基因反转录PCR和实时定量PCR所用引物见附录表S1电泳迁移率分析(EMSA)根据说明书用一个非同位素方法轻移发光EMSA试剂盒（Thermo Scientific），检测DNA–蛋白复合物用四种生物素标记的寡核苷酸（G-box，GCC盒，W-box，E-box）作为探针（20 nm；补充表S1）一个2ug OsbHLH65-MBP融合蛋白的样品在20 uL反应混合物中室温下搅拌20分钟用结束标记DNA中孵育蛋白酶因子Xa（0.2 LG；NEB）被添加到反应混合物中除去麦芽糖结合蛋白（MBP）然后，反应样品（20ul）用6.5%天然聚丙烯酰胺凝胶电泳然后转尼龙膜通过davinch-Chemi TM cas-400sm检测DNA–蛋白质复杂的图像（davinch-Chemi）用于EMSA检测所有探针都在补充表S1列出酵母菌双杂系统筛选媒人TM图书馆建设和筛选工具(Clontech)是用于分析蛋白质相互作用根据制造商的协议构建一个GAL4广告融合图书馆,我们使用池rna提取o .漂白亚麻纤维卷叶处理稻瘟病,前列腺肥大,乙烯利,我是的,或SA。

开放阅读框(ORF)Os MPK3 c DNA克隆在坐标系到pGBKT7向量被用作诱饵屏幕cDNA表达文库酵母b-galactosidase化验,Os MPK3-p GBKT7和Osb HLH65-p GADT7 constructswere co-transformed酵母AH109应变转换后的酵母细胞培养在合成辍学介质(缺乏低浓缩铀,Trp,他和正面)根据说明书Matchmaker文库的构建和筛选试剂盒（Clontech）用于分析–蛋白相互作用我们混合稻瘟病，BPH，乙烯利，MeJA和SA处理下的水稻叶片提取的RNA以构建一个GAL4 AD文库以OsMPK3的 cDNA的开放阅读框（ORF）克隆到质粒载体上以筛选cDNA表达文库构建的osmpk3-pgbkt7和osbhlh65-pgadt7共转化酵母菌AH109菌株，以测定酵母β-半乳糖苷酶转化的酵母细胞在缺失培养基上培养（缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤）结果和讨论序列比较和系统发育分析OsMPK3OsMPK3，与OmMPK同源，是水稻栽培稻的野生稻O.minuta在以前的研究中获得数据的褐飞虱和稻瘟病抗病因子（Cho等.110你等。

2007）被选为种植水稻的抗病因素o .马唐基于之前的研究中获得的数据在一个普通野生稻minuta,这是抗稻瘟病和BPH(Cho et al.2005;You et al . 2007)OsMPK3，与OmMPK之间氨基酸序列同源性为99%(数据没有显示)OsMPK3曾有两个不同的名字，OsMPK3，O。