蛋白酶活性的测定方法.docx

蛋白酶活性的测定方法（GB/T23527-2009）1 原理 蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用磷钨酸和 磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合 物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）由于蛋白质中含有具有酚基 的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也 呈此反应利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应， 来间接测定蛋白酶的活力2 仪器和设备2.1分析天平：精度0.OOOlg2.2 恒温水浴：精度土 0.2°C2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计：精度O.OlpH单位3 试剂和溶液3.1乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%） 10.6g,加水溶解并定容至1000ml 乙液：称取乳酸钠（70%） 16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳 酸缓冲溶液3.2磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶 准确称取磷酸氢二钠（Na HPO .12H O） 6.02和磷酸二氢钠（NaH PO .2H O）2 3 2 2 3 20.5g,加水定容至1000ml3.3硼酸缓冲液（pH=10.5）适用于碱性蛋白酶 甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。

乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸，以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L 的 NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml 酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液（若 为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴）润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约 80ml,在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解,冷却后，转入100ml容量 瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100 口 g/ml酪氨酸标准溶液3.8.1准确称取预先于105C干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用O.lmol/L盐酸定容至 100ml,即得100.0 口 g/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解 并用玻璃棒捣研，然后将上清液倒入100ml容量瓶，沉渣中再添入少量缓 冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。

滤液 可作为测试酶用.该酶已经稀释100倍4 分析步骤4.1 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液按下表配制试管号012345取 100 u g/ml 酪氨溶液( ml )012345蒸馏水（ ml ）1098765酪氨酸实际浓度（u g/ml ）010203040504.2分别取上述溶液各1.00ml（须做平行试验），各加0.4mol/L碳酸钠 溶液5.00ml福林试剂使用溶液1.00ml,置于40+0.2°C水浴中显色20min, 取出用分光光度计于波长680nm,比色，以不含酪氨酸的0管为空白管调 零点，分别测定其吸光度值，以吸光度值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐 标，绘制标准曲线或计算回归方程计算出当OD为1时的酪氨酸的量（口 g）,即为吸光常数K值，其K值应在95~100范围内4.3 样品测定：4.3.1先将酪素溶液放入40±0.2C恒温水浴中，预热5min4.3.2取4支试管，各加入1ml酶液4.3.3取一支作为空白管，加2ml三氯乙酸，其他3管作为测试管各加入 1ml酪素，摇匀，40C保温10min4.3.4取出试管，3支测试管中各加入2ml三氯乙酸，空白管中加1ml酪 素4.3.5静置10min，过滤沉淀4.3.5各取1ml滤液，分别加0.4mol/L的Na CO 5ml、福林试剂1ml。

在40C显色20min680nm处测0D值以空白管调零点注：1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸制剂，除反应与显色温度为 30C±0.2C外，其他操作同上，标准曲线做同样处理5.计算5.1酶活定义：lg固体酶粉（或1 ml液体酶），在40°C（酸性pH=3・0、中性pH=7・5、 碱性pH=10.5 ）条件下，1min水解酪素产生1 u g酪氨酸为一个酶活力单 位5.2 计算酶的活性单位依据以下公式蛋白酶的活力二AXKX4/10Xn U/g（ml）A：样品平行试验的平均OD值。