15研究微生物的基本方法.doc

第5章研究微生物的基本方法随着现代医学及相关科学技术的发展，各学科相互交叉和渗透，医学微生物学检验技术 已深入到细胞、分了和基因水平，许多新技术、新方法已在临床微生物实验室得到广泛应用 医学微生物学实验室的基木任务之一是利用微生物学检验技术，准确、快速检验和鉴定临床 标木中的微牛物，并对引起感染的微牛物进行耐药性监测，为临床对感染性疾病诊断、治疗、 流行病学调查及研究等提供科学依据第一节显微镜观察由于细菌个体微小，肉眼不能看到，必须借助显微镜的放大才能看到一般形态和结构 可用光学显微镜观察，其内部的超微结构则需用电了显微镜才能看清楚常用显微镜有如下 几种1. 普通光学显微镜采用自然光或灯光为光源，其波长约为0.4U mo显微镜的分辨率为波长的二分之一，即 0.2um,而肉眼可见的最小形象为0. 2mmo故用油（浸）镜放大1 000倍，能将0. 2 n m的微 粒放大成肉眼可见的0.2mmo普通光学显微镜可用于细菌、放线菌和真菌等的观察2. 暗视野显微镜常用于观察不染色微生物形态和运动在普通显微镜安装暗视野聚光器后，光线不能从 中间直接透入，视野呈暗色，当标木接受从聚光器边缘斜射光后可发生散射，因此可在暗视 野背景下观察到光亮的微生物如细菌或螺旋体等。

3. 相差显微镜相差显微镜利用相差板的光珊作用，改变直射光的光位相和振幅，将光相的差界转换为 光强度并在和并显微镜下，当光线透过不染色标木时，由于标木不同部位的密度不一致而 引起光相的差异，可观察到微生物形态、内部结构和运动方式等4. 荧光显微镜荧光显微镜与普通光学显微镜基木相同，主要区别在于光源、滤光片和聚光器口前大 多数使用的是落射光装置，常用高压汞灯作为光源，可发出紫外光或蓝紫光滤光片有激发滤光片和吸收滤光片二种用蓝光的荧光显微镜除可用一般明视野聚光器外，也可用暗视野 聚光器，以加强荧光与背景的对比木法适用于对荧光色素染色或与荧光抗体结合的细菌的 检测或鉴定5. 电子显微镜用电子流作为光源，波长与可见光相比差几万倍，大大提高了分辨力，并用磁性电圈作 为光学放大系统，放大倍数可达数万倍或儿I•万倍，常用于病毒颗粒和细菌超微结构的观察8. 2制片和染色%1. 非染色标本非染色标木一般可用于观察细菌形态、动力及运动情况细菌未染色吋无色透明，在显 微镜下主要靠细菌的折光率与周围环境的不同來进行观察有鞭毛的细菌运动活泼，无鞭毛 的细菌则呈不规则布朗运动梅毒苍白密螺旋体、钩端螺旋体、弯曲杆菌等的活菌各有特征 鲜明的形态和运动方式，具有诊断意义。

常用的方法有压滴法、悬滴法和毛细管法等1. 悬滴法在洁净凹玻片的凹孔四周涂上凡士林，用接种环取一环菌悬液放在盖玻片中央，再将凹 玻片的凹孔对准盖玻片中央的液滴并盖上，然后迅速翻转，轻压盖玻片，使其与凹孔边缘的 凡士林粘紧封闭后置高倍镜下（或暗视野）观察2. 压滴法用接种环取一环菌悬液置于洁净玻片的中央，在菌悬液上轻轻盖上一盖玻片，注意避免 产生气泡并防止菌悬液外溢，静止数秒钟后置高倍镜下明视野（或暗视野）观察3. 毛细管法主要用于厌养菌动力的检查通常选用60^70mm长0. 5~1・Omni孔径的毛细管虹吸厌养 菌悬液后，用火焰将毛细管两端熔封并用塑胶纸将毛细管固定在载玻片上，置高倍镜下暗 视野观察二、染色标本检查细菌标木经染色后，由于细菌与周围环境间在颜色上形成鲜明对比，故在普通光学显微 镜下可清楚地观察到细菌的形态特征（如细菌的大小、形状、排列等）和某些特殊结构（如 荚膜、鞭毛、芽鞄等），并可根据染色反应性对细菌加以分类鉴定细菌染色的一般程序细菌染色的一般程序是：涂片（干燥）一固定一染色（媒染）一（脱色）一（复染）1. 涂片制备血液、分泌物、排泄物、穿刺液和液体培养物，直接在载玻片上作薄膜涂片；尸检或感 染动物组织，病变局部涂抹采样的棉拭子直接涂片。

固体培养基上的菌落或菌苔的制片，先 用接种环取一环生理盐水置载玻片中央，再用无菌接种环取少量的培养物在生理盐水中磨匀, 涂布成lcm2大小的涂面，置室温下自然干燥或远火慢慢烘干2. 固定目的是杀死细菌，凝固细菌蛋口及结构，便于染色；促使细菌粘附在载玻片上，避免在 水洗过程中被水冲掉；改变细菌对染料的通透性，有利于菌细胞内结构的染色通常用火焰 加热固定，将己干燥的涂片在火焰中迅速通过3次，以手背皮肤接触玻片不烫为佳3. 染色根据检验目的不同，选择不同的染色方法进行染色染色时滴加染液，以复盖标本为度4. 媒染凡能增强染料和被染物的亲和力，使染料固定于被染物及能引起细胞膜通透性改变的物 质，称媒染剂常用的有明矶、糅酸、金属盐和碘等，也有用加热法促进着色媒染剂可用 于初染与复染之间，也可用于固定之后或含于固定液、染色中5. 脱色凡能使己着色的被染物脱去颜色的化学试剂称为脱色剂常用乙醇、内酮等作为脱色剂 脱色剂可以查出细菌与染料结合的稳定程度，作为鉴別染色Z用6. 复染已脱色处理的细菌或其结构常以复染液作复染以便于观察复染液与初染液的颜色不同 而成一鲜明对比复染不宜太强，以免掩盖初染的颜色常用染色法1. 单染色法只用一种染料染色。

由于大多数细菌胞浆内含有酸性物质，可与碱性染料结合，故常用 吕氏美蓝、结晶紫和稀释石碳酸复红等染液此法可观察细菌的大小、形态与排列，不能显 示细菌的结构与染色特性2. 复染色法用两种或两种以上不同染料可将细菌染成不同的颜色，除可观察细菌的大小、形态与排 列外，还反应出细菌染色特性，具有鉴别细菌种类的价值常用的有革兰染色法和抗酸染色 法1）革兰染色：①细菌涂片经火焰固定，加结晶紫染液染lmin,清水冲去染液②加 碘液媒染Imin,水洗，甩干③用95%乙醇脱色，轻轻摇动约30s,至无紫色洗落为止，水 洗，甩干④加稀释石碳酸复红或沙黄染液数滴进行复染，约30s,水洗⑤干后显微镜下 镜检观察结果，革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌为红色2)抗染色:萋-尼（Ziehl-Neelse）抗酸染色法：①细菌涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾染液因蒸发减少时，应随时补充，防止染 液蒸干持续染5min （奴卡菌需要加长时间），水洗，甩干②滴加3%盐酸乙醇脱色，不时 摇动玻片至无红色脱落为止，水洗，甩干③加吕氏美蓝复染液数滴复染lmin,水洗④干 后显微镜下镜检观察结果，抗酸杆菌染成红色，非抗酸杆菌为蓝色。

金胺0-罗丹明B染色法：①细菌涂片固定后加第1液30~90s②弃去第1液后加第2 液染15mino③用第3液脱色「2min,水洗④滴加第4液染30s,水洗，⑤干后•置荧光显 微镜下镜检观察结果 在淡蓝色背景下，抗酸杆菌呈红色，其它细菌和细胞呈蓝色3. 特殊染色法（1） 鞭毛染色（改良Ryu法人①玻片的处理 将新载玻片浸泡在95%乙醇中临用时 取出，以干净纱布擦干②在玻片上滴蒸谓水1滴③挑取培养物少许，轻触蒸憾水滴顶部, 仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落④置35C孵箱自然干燥，不能用火 焰固定，滴加鞭毛染液染「2 min轻轻水洗⑤干后显微镜镜检观察结果鞭毛和菌体呈紫 色2） 异染颗粒染色（阿尔培托法）：①细菌涂片经火焰固定，加甲液染色3~5min ②滴加乙液，染lmin0水洗③干后显微镜镜检观察结果 菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色, 用于白喉棒状杆菌染色3）荚膜染色：①奥尔特英膜染色法:将已固定的细菌涂片滴加3%沙黄染液，用火焰加温染色，持续3min,冷却后水洗，待干镜检结果：菌体呈褐色，荚膜呈黄色，此法主要 用于碳疽芽胞杆菌②Hiss氏硫酸铜法：染液：第一液为结晶紫乙醇饱和液5i】il加蒸徭水95ml的混合液；第二液为20%硫酸铜水溶液。

方法：细菌涂片口然干燥，乙醇固定滴加第-液，微加热染lmin再用第二液将涂片上的染液洗去，勿再水洗，倾去硫酸铜液，以吸水 纸吸干镜检结果：菌体及背景呈紫色，荚膜呈鲜蓝色或不着色4）芽胞染色：染液：第一液为萋一纳氏石炭酸复红液，第二液为95%乙醇，第三液为 碱性美蓝液方法：将已固定的细菌涂片滴加第一液，微加热染5min,冷却后水洗用笫二 液脱色2min,水洗加第三液复染lmin,水洗，待T•镜检结果：菌体呈蓝色，芽胞呈红色4. 负染色法背景着色而菌体木身不着色的染色为负染色法最常见的是墨汁负染色法，用來观察真 菌及细菌荚膜等在标本涂片处滴加染液，混合后加上盖玻片（勿产生气泡），轻压在低倍 镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜或油镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景 为黑色5. 荧光染色法经荧光素染色的细菌，或荧光素标记的荧光抗体与相应抗原的细菌、病毒结合形成的复 合物，在荧光显微镜下发出荧光 3微生物接种和培养大多数细菌均可以通过人工方法培养，而衣原体和病毒的分离培养往往需要活组织、鸡 胚、特殊细胞株及动物接种只有将微生物培养出来才能对它进行研究、鉴定和应用一、接种与分离方法根据待检标本的性质、培养目的和所用培养基的种类，采用不同的接种方法。

1. 平板划线分离培养法对混有多种细菌的临床标本，采用划线分离和培养，使原来混杂在一起的细菌沿划线在 琼脂平板表面分离，得到分散的单个菌落，以获得纯种临床送检的标木如痰、咽试了、泌 尿牛殖道的分泌物和粪便等细菌检验均需要借助琼脂平板划线分离目的菌平板划线分离法 通常有两种方法：（1） 分区划线分离法：此法常用于含菌量较多的标本如痰、泌尿生殖道的分泌物和粪便 或混合细菌的分离先用接种环挑取标木涂布于琼脂平板1区（占培养基总面积的1/4）并 作数条划线，再于2、3、4区依次划线毎划完一个区域，均将接种环烧灼灭菌1次，冷后 再划下一区域，每一区域的划线均与上一区域的划线交接广3次一个成功分区划线的平板, 培养后分别观察1区形成菌苔，2区菌落连成线，3区和4区可分离到单个菌落2） 连续划线分离法：此法常用于含菌量不多的标木或培养物中的细菌分离培养方法 是先将接种物在琼脂平板上1/5处轻轻涂抹，然后再用接种环或拭子在平板表面曲线连续划 线接种，直至划满琼脂平板表面2. 琼脂斜面接种法主要用于菌落的移种，以获得纯种进行鉴定和保存菌种等用接种环（针）挑取单个菌 落或培养物，从培养基斜面底部向上划一条直线，然后再从底部沿直线向上曲折连续划线， 直至斜面近顶端处止。

生化鉴定培养基斜面接种，用接种针挑取待鉴定细菌的菌落，从斜面 中央垂直刺入底部，抽出后在斜面上由下至上曲折划线接种3. 穿刺接种法此法多用于半固体培养基或双糖铁、明胶等具有高层的培养基接种，半固体培养基的穿 刺接种可用于观察细菌的动力接种吋用接种针挑取菌落，由培养基垂直刺入至距管底 0.4cm处，再沿穿刺线退出接种针双糖铁等有高层及斜面之分的培养基，穿刺高层部分， 退出接种针后直接划线接种斜面部分4. 液体培养基接种法用于各种液体培养基如肉汤、蛋口陈水、糖发酵管等的接种用接种环挑取单个菌落， 倾斜液体培养管，在液面与管壁交界处研磨接种物(以试管直立后液体淹没接种物为准)此 接种法应避免接种环与液体过多接触，更不应在液体中混匀、搅拌，以免形成气溶胶，造成 实验室污染5. 倾注平板法木法主要用于饮水、饮料、牛乳和尿液等标木中的细菌计数取纯培养物的稀释或原标 本lml至无菌培养皿内，再将己融化并冷却至45~50C左右的琼脂培养基15^20ml倾注入该 无菌培养皿内，混匀，待凝固后置37C培养，长出菌落后进行菌落计数，以求出每毫升标木 中所含菌数。