《多位点序列分型》PPT课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,多位点序列分型 Multilocus Sequencing TypingMLST,Contents,两种分型方法的比较,MLST的步骤,MLST的方案设计,MLST的由来,实例分析,多位点酶电泳（Multilocus enzyme electrophoresis,MLEE）,根据酶的电泳迁移率的不同来描述变异,选定管家酶,淀粉胶检测,不同电泳迁移速率,电泳谱,等位基因的变异性,揭示微生物基因多样性,MLEE的缺点,不能推断特殊位点的碱基序列,不同实验室间的分型结果不能进行比较,MLST的首次使用,MLST是由多位点酶电泳(MLEE)衍生出来的,一种分型方法,在1998年,Maiden等首次将MLST应用于脑膜炎奈瑟菌分型,多位点序列分型（,MLST）,一种基于核酸序列测定的细菌分型方法,通过PCR扩增多个管家基因内部片段,测定其序列，分析菌株的变异,MLST的原理,MLST方法一般测定610个管家基因内部400600bp的核苷酸序列，每个位点的序列根据其发现的时间顺序赋予一个等位基因编号，每一株菌的等位基因编号按照指定的顺序排列就是它的等位基因谱，也即是这株菌的序列型（sequence type,ST）。

这样得到的每个ST均代表一组单独的核苷酸序列信息序列型（ST）,序列型（Sequence-typying,STs）等同于MLEE得出的电泳型(Electrophoretic type,ET）,通过比较ST可以发现菌株的相关性,即密切相关菌株具有相同的ST或仅有极个别基因位点不同的ST,而不相关菌株的ST至少有3个或3个以上基因位点不同,MLST分析方法,MLST技术针对看家基因设计引物对其进行PCR扩增和测序,得出每个菌株各个位点的等位基因数值,然后进行等位基因图谱(allelic profile)或序列类型(sequence types,STs)鉴定，,再根据等位基因图谱使用配对差异矩阵(matrix pair-wise differences)等方法构建系统树图进行聚类分析MLST方案的设计,三要素：,选择经过初步筛选的菌株,选择具有独特特征的基因位点,设计用于基因扩增和序列测定的引物,1.菌株的选择,根据已有的分型方法和流行病学资料，选择100株左右具有代表性的菌株作为分析对象理论上，这些选定的菌株要代表所研究细菌的群体，而不是仅仅包含那些对人致病的克隆收集的菌株最好具有代表性，不仅仅由一个亚型组成。

2.管家基因的确定,全基因组序列的测定大大方便MLST位点的选择一般选择10到20株菌评价10至15个备选位点最终采用 7个位点进行后续实验和分析如果需要提高分辨力，可以加入个别非保守的基因，例如表面抗原基因或者毒力基因，这样比增加管家基因的个数将更有效,3.引物的设计,目的片段长度：400600bp,所有引物调整为同一退火温度，以适用于大范围流行病学监测和群体研究,为了发现引物结合位点可能存在的变异，每个位点都应该设计一对以上引物,http:/pubmlst.org/,实际运用中，对于已有的成熟MLST方案的细菌，可直接从MLST数据库中获取方案http:/pubmlst.org/,MLST的步骤（二）核酸序列信息的获取,收集病原微生物标本,基因组DNA的获取,PCR扩增目的基因片段,目的片段的核酸序列测定,整合核酸序列信息,MLST的步骤（三）结果分析,结果分析,根据分析的细菌群体组成,1.以等位基因编号和ST编号为基本分析单位,提交到MLST分析网络服务器（）,START和eBURST,2.直接分析核苷酸序列,上传到GenBank比对服务器进行BLAST比对验证,数据分析得到等位基因图谱,新的STs则找出对应的clonal complex,在数据库中找出相应的STs,群体进化研究,分子流行病学研究,菌群结构调查,菌群遗传学分析,疾病的全球性监控,鉴定暴发性疾病的病原体,MLST结果分析流程图,ST和克隆型,遗传学上具有相关性但并不相同的细菌的集合,被称为是同源复合体(The clonal complex),也叫克隆型。

以其核心的基因型来命名MLST和PFGE的比较两种不同的分子分型技术,不同分子分型方法比较,分型方法,分型力,可分辨率,可重复性,结果易解释性,易操作性,费用,RAPD,较好,较高,一般,一般,简便,低,PCR-RFLP,好,一般,一般,一般,简便,低,AFLP,较好,高,一般,好,简便,中,MLST,较好,较高,好,好,简便,较高,PFGE,好,高,好,好,复杂,较高,MLVA,很好,高,好,好,简便,高,MLST和PFGE的比较两种不同的分子分型技术,脉冲场凝胶电泳（PFGE）,比较所确定的高度变异片段,高分辨力,不适于进行全面的流行病学调查及生物进化分析,不同实验间重复性较差,标准化技术,数据库,多位点序列分型（MLST）,比较进化较慢的位点,标准化技术,数据库,不同实验室间重复性好,不适用于同血清型菌株间比较,MLST实例分析,1.MLST方案（同MLST Database）,2.核酸序列信息的获取,2.1样本来源,54株结肠弯曲菌(C.coli)分离于2002年零,售禽肉中，均为不重复菌株,2.2PCR扩增,2.3测序,3.结果分析,3.1.MLST数据提交,将测序序列递交至弯曲菌MLST数据库()进行分析,得出,等位基因型,、,序列型,以及,序列型克隆系,。

3.2UPGMA分析ST序列型的发育树,谢谢！,。