分子发光分析法课件.ppt

第五章第五章 分子发光分析法分子发光分析法分析化学分析化学  物质分子吸收了物质分子吸收了一定能量一定能量后后,其电子由基其电子由基态跃迁至激发态态跃迁至激发态,当激发态分子以辐射形当激发态分子以辐射形式将其能量释放返回基态时式将其能量释放返回基态时,便产生分子便产生分子发光根据这种现象建立的分析方法称发光根据这种现象建立的分析方法称为为发光分析法发光分析法•根据分子受激时所吸收能源及辐射光的根据分子受激时所吸收能源及辐射光的机理不同分为以下几类：机理不同分为以下几类： 光致发光：以光致发光：以光源光源来激发而发光来激发而发光 电致发光：以电致发光：以电能电能来激发而发光来激发而发光 生物发光：以生物发光：以生物体释放的能量生物体释放的能量激发而激发而发光发光 化学发光：以化学发光：以化学反应能化学反应能激发而发光激发而发光•分子荧光和磷光分析分子荧光和磷光分析•化学发光化学发光一、基本原理•1 1、荧光和磷光的产生、荧光和磷光的产生•室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层室温下，大多数分子处于基态的最低振动能层。

处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态处于基态的分子吸收能量后被激发为激发态激发态不稳定，将很快衰变为基态若返回到激发态不稳定，将很快衰变为基态若返回到基态时伴随着光子的辐射，这种现象成为基态时伴随着光子的辐射，这种现象成为“发发光光”由于吸收光能而导致的发光称为光致发由于吸收光能而导致的发光称为光致发光处于基态的分子吸收能量后发处于基态的分子吸收能量后发生跃迁：生跃迁：激发态分子的去活化过程激发态分子的去活化过程 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量，称为去活化过迁（发光）和无辐射跃迁等方式失去能量，称为去活化过程去去活活化化非非辐辐射射跃跃迁迁化化学学反反应应发发射射光光子子振动驰豫振动驰豫内转换内转换系间跨越系间跨越外转换外转换熄灭或猝灭熄灭或猝灭荧光荧光磷光磷光激发光去除后，磷光不会立即消失激发光去除后，磷光不会立即消失激发光去除后，荧光立即消失激发光去除后，荧光立即消失荧光和磷光体系能级图2 2、激发光谱和发射光谱、激发光谱和发射光谱•激发光谱:固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ）•激发光谱形状与吸收光谱形激发光谱形状与吸收光谱形状极为相似，经校正后二者状极为相似，经校正后二者完全相同！完全相同！ •发射光谱：固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。

激发光谱和发射光谱的关系•A . Stokes位移位移•B .发射光谱的形状与激发波长无关发射光谱的形状与激发波长无关•C . 镜像规则镜像规则A.A.基态上的各振动能级分布与第一激基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似发态上的各振动能级分布类似•激发：基态激发：基态→第一激发态各振动能级，振动能级第一激发态各振动能级，振动能级越高，能级差越大，波长就越短越高，能级差越大，波长就越短•　　•发射荧光：从第一激发态的最低振动能级发射荧光：从第一激发态的最低振动能级→基态基态的各振动能级，基态的振动能级越高，其能量差的各振动能级，基态的振动能级越高，其能量差越小，波长就越长越小，波长就越长•　　•吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级吸收光谱中能级越高波长越短，发射光谱中能级越高，波长越长互为镜像越高，波长越长互为镜像4043211023B.B.基态上的零振动能级与第一激发态基态上的零振动能级与第一激发态的振动能级之间的跃迁几率最大，相的振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然反跃迁也然 3 3、荧光与分子结构的关系（内因）、荧光与分子结构的关系（内因）•分子荧光产生的必备条件分子荧光产生的必备条件:•分子必须具备与所照射的辐射频率相适应的结分子必须具备与所照射的辐射频率相适应的结构构•吸收激发光的分子必须具有一定的荧光量子产吸收激发光的分子必须具有一定的荧光量子产率率影响因素：荧光产生过程中，影响因素：荧光产生过程中， 辐射和无辐射过程；辐射和无辐射过程； 与每一过程的速率常数有关；与每一过程的速率常数有关； Kf 分子结构决定（内因）；分子结构决定（内因）； 主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定。

主要取决于化学结构和化学环境和结构共同决定荧光与分子结构的关系（外因）荧光与分子结构的关系（外因）•（（1）跃迁类型：）跃迁类型：具有具有电子跃迁类型的结构电子跃迁类型的结构 （（2 2）、共轭效应）、共轭效应•具有共轭体系的芳环或杂环化合物，具有共轭体系的芳环或杂环化合物，  电子电子共轭程度越大，越易产生荧光共轭程度越大，越易产生荧光; 环越多，共环越多，共轭程度越大，产生荧光波长越长（红移），轭程度越大，产生荧光波长越长（红移），发射的荧光强度越强发射的荧光强度越强•（（3 3）、）、 刚性平面结构刚性平面结构——较稳定的平面结较稳定的平面结构构（（（（4 4 4 4）取代基效应）取代基效应）取代基效应）取代基效应1 1 1 1）给电子取代剂加强荧光）给电子取代剂加强荧光）给电子取代剂加强荧光）给电子取代剂加强荧光•————HNHNHNHN2 2 2 2，，，， ———— NHR NHR NHR NHR ，，，， ————NRNRNRNR2 2 2 2，，，， ———— OH OH OH OH，，，， ———— OR OR OR OR ，，，， ———— CN CN CN CN•产生产生产生产生 p p p p →→→→ππππ共轭共轭共轭共轭相对荧光强度相对荧光强度1018202020λ emmax (nm)278~310285~365310~405280~390285~345化合物化合物苯苯苯酚苯酚苯胺苯胺苯基氰苯基氰苯甲醚苯甲醚2 2 2 2）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光）吸电子取代基减弱荧光、加强磷光•芳环上被芳环上被F F、、ClCl、、BrBr、、I I 取代后，使系间窜跃取代后，使系间窜跃加强，磷光增强，荧光减弱。

其荧光强度随卤加强，磷光增强，荧光减弱其荧光强度随卤素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效素原子量增加而减弱，磷光相应增强，这种效应为应为重原子效应重原子效应 其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间的相其原因是重原子的电子自旋和轨道运动间的相互作用变大，原子核附近产生磁场，使单重态互作用变大，原子核附近产生磁场，使单重态向多重态系间跨越的几率增加向多重态系间跨越的几率增加(2)(2)影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素•溶剂的影响溶剂的影响（增大溶剂的极性荧光增强）（增大溶剂的极性荧光增强）•温度的影响温度的影响•酸度的影响酸度的影响（芳香族化合物的官能团，金属与有（芳香族化合物的官能团，金属与有机试剂螯合）机试剂螯合）•内滤光和自吸收现象内滤光和自吸收现象•散射光的影响散射光的影响(3)(3)溶液荧光的猝灭溶液荧光的猝灭 荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或荧光强度不与浓度成线性关系引起荧光强度降低或荧光强度不与浓度成线性关系的现象称为的现象称为荧光猝灭荧光猝灭能引起荧光猝灭的物质叫能引起荧光猝灭的物质叫荧光熄灭剂荧光熄灭剂•碰撞猝灭碰撞猝灭 M+hM+hv v→M→M*,M*+Q →*,M*+Q → M+M+热热•静态猝灭静态猝灭 M+Q →M+Q → MQ MQ 非荧光物质非荧光物质•转入三重态的猝灭转入三重态的猝灭 引入碘、溴后，易发生体系引入碘、溴后，易发生体系间跨越间跨越•荧光物质的自猝灭荧光物质的自猝灭 荧光物质浓度较高荧光物质浓度较高•发生电荷转移反应的猝灭发生电荷转移反应的猝灭二、荧光（磷光）光谱仪荧光分光光度计的主要部件：荧光分光光度计的主要部件：光源、激发单色器、发射光源、激发单色器、发射单色器、样品池、检测系统、显示系统。

单色器、样品池、检测系统、显示系统光源光源激发单色器激发单色器样品池样品池发发射射单单色色器器检测器检测器放大器放大器指示器指示器·记录器记录器与分光光度计与分光光度计有两点不同：有两点不同：①①两个单色器两个单色器②②检测器与激发光检测器与激发光成直角成直角1.1.光源光源•激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽的发射强度；适用波长范围宽•荧光光度计中常用荧光光度计中常用高压汞灯高压汞灯和和氙弧灯氙弧灯利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的利用汞蒸气放电发光的光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射光源；常用其发射365 nm365 nm、、、、405 nm405 nm、、、、 436 nm 436 nm 三条谱线三条谱线三条谱线三条谱线以以以以365 nm 365 nm 的谱线最强的谱线最强的谱线最强的谱线最强应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250~800nm很强的连续光源很强的连续光源2 2、单色器、单色器•第一单色器作用第一单色器作用：：激发单色器激发单色器，分离出所，分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长需要的激发光，选择最佳激发波长  ex 。

•第二单色器作用第二单色器作用：：发射单色器，发射单色器，滤掉一些滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长测定用的荧光波长  em•3 3、样品池、样品池•通常是通常是石英石英材料的方形池，材料的方形池，四面都透光四面都透光，，只能用手拿棱或最上边只能用手拿棱或最上边•4 4、检测器、检测器•荧光的强度一般较弱，要求检测器有较荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增光电倍增管管SK-2003A型荧光光谱仪型荧光光谱仪(国内首创）国内首创）磷光分析法•与荧光相比，磷光的特点：与荧光相比，磷光的特点：•1 1、磷光寿命比荧光长、磷光寿命比荧光长•2 2、磷光辐射的波长比荧光长、磷光辐射的波长比荧光长•（一）磷光强度：（一）磷光强度： IpIp＝＝KCKC•（二）温度对磷光强度的影响（二）温度对磷光强度的影响 试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（77K77K）或液氦）或液氦（（4K4K）下测定）下测定磷光分析仪器磷光分析仪器•与荧光分析仪器相似，主要差异如下：与荧光分析仪器相似，主要差异如下： 1. 1. 试样室试样室•试样需在液氮温度（试样需在液氮温度（77K77K）或液氦（）或液氦（4K4K）下测）下测定－低温磷光（将液池放在盛放液氮的定－低温磷光（将液池放在盛放液氮的杜瓦瓶杜瓦瓶内）内） 固体表面室温磷光固体表面室温磷光分析需特制试样室分析需特制试样室 2. 2. 磷光镜磷光镜•有些物质既可产生荧光，又能产生磷光。

有些物质既可产生荧光，又能产生磷光用机用机械切光装置械切光装置————磷光镜区别荧光和磷光利用磷光镜区别荧光和磷光利用荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰荧光寿命短，磷光寿命长消除荧光干扰 磷光仪器在荧光仪磷光仪器在荧光仪样品池上增加磷光样品池上增加磷光配件：配件：低温杜瓦瓶低温杜瓦瓶和斩光片和斩光片如右图所示斩光片的作所示斩光片的作用是利用其分子受用是利用其分子受激所产生的荧光与激所产生的荧光与磷光的寿命不同获磷光的寿命不同获取磷光辐射（书中取磷光辐射（书中96页）页）•室温磷光室温磷光低温荧光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，低温荧光需低温实验装置且受到溶剂选择的限制，19741974年后发展了室温磷光（年后发展了室温磷光（RTPRTP）1 1）固体基质室温磷光）固体基质室温磷光 在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，在室温下以固体基质（如纤维素等）吸附磷光体，增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而增加分子刚性、减少三重态猝灭等非辐射跃迁，从而提高磷光量子效率提高磷光量子效率2 2）胶束增稳室温磷光）胶束增稳室温磷光 利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改利用表面活性剂在临界浓度形成具多相性的胶束，改变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转变磷光体的微环境、增加定向约束力，从而减小内转换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性。

换和碰撞等去活化的几率，提高三重态的稳定性3 3）敏化溶液室温磷光）敏化溶液室温磷光三、荧光分析方法和应用三、荧光分析方法和应用•1 1、荧光分析法分类、荧光分析法分类•一、直接荧光法：一、直接荧光法：芳香族有机化合物分析芳香族有机化合物分析 二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）二、间接荧光法（衍生化法和荧光探针法）•2 2、荧光分析法的特点：、荧光分析法的特点：•（（1 1）灵敏度高）灵敏度高 比紫外比紫外- -可见分光光度法高可见分光光度法高2 2~ ~4 4个数量级，个数量级，检测下限在检测下限在0.10.1~ ~0.001μg /0.001μg /mLmL•（（2 2）选择性好）选择性好 荧光法既能依据特定发射，又能依据特定荧光法既能依据特定发射，又能依据特定吸收来鉴定物质吸收来鉴定物质•（（3 3）试样量少和方法简单）试样量少和方法简单•（（4 4）提供比较多的物理参数）提供比较多的物理参数3 3、应用、应用•一、定性分析一、定性分析 荧光物质的特征光谱有荧光物质的特征光谱有激发光谱激发光谱和和荧光光谱荧光光谱两种，两种，可以将荧光物质的特征光谱与标准物质的光谱比可以将荧光物质的特征光谱与标准物质的光谱比较，以确定是否为同一物质。

较，以确定是否为同一物质•二、定量分析二、定量分析•定量分析依据定量分析依据 F = KCF = KC三、三、 无机化合物的分析无机化合物的分析•无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定无机化合物中，能直接产生荧光并应用于测定的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有的为数不多，但与有机化合物生成发荧光的有机配合物后，进行荧光分析的元素达几十种，机配合物后，进行荧光分析的元素达几十种，其中较常采用荧光法测定的元素有：其中较常采用荧光法测定的元素有：BeBe、、AlAl、、B B、、GaGa、、SeSe、、MgMg、、ZnZn、、CdCd及某些稀土元素及某些稀土元素n n荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法荧光猝灭法也是荧光分析中经常采用的方法可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：可采用荧光猝灭法间接测定的离子有：F F F F- - - -、、、、S S S S2-2-2-2-、、、、CoCoCoCo2+2+2+2+、、、、NiNiNiNi2+2+2+2+、、、、CuCuCuCu2+2+2+2+等等等等•2. 2. 有机化合物的分析有机化合物的分析•脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身脂肪族有机化合物的分子结构较为简单，本身能发荧光的很少，芳香族化合物因具有共轭的能发荧光的很少，芳香族化合物因具有共轭的不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法不饱和体系，多数能发荧光；可直接用荧光法测定。

但是为提高荧光分析的灵敏度和选择性，测定但是为提高荧光分析的灵敏度和选择性，大多数采用荧光大多数采用荧光衍生化法衍生化法•3.3.荧光检测与色谱分离联用荧光检测与色谱分离联用•4.4.荧光免疫分析荧光免疫分析化学发光分析一、概述一、概述•化学发光是吸收化学反应所释放化学能而使分化学发光是吸收化学反应所释放化学能而使分子发光所建立的分析方法子发光所建立的分析方法•化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的化学发光与荧光的主要区别：受激发时所需的能量来源能量来源不同，需要化学反应过程中所提供的不同，需要化学反应过程中所提供的化学能化学能化学发光分析具有以下特点•灵敏度高灵敏度高————例：用荧光素酶和三磷酸腺苷例：用荧光素酶和三磷酸腺苷ATPATP的化的化学发光反应，可测定低至学发光反应，可测定低至2 2××1010-17-17 mol mol··L-1L-1的的ATPATP•线性范围宽线性范围宽————一般有一般有5~65~6个数量级个数量级•仪器设备简单，成本低廉仪器设备简单，成本低廉•分析速度快，易实现自动化分析速度快，易实现自动化•局限性局限性：可供发光用的试剂有限：可供发光用的试剂有限 发光机理有待进一步研究发光机理有待进一步研究二、化学发光分析的基本原理（一）化学发光反应的基本条件（一）化学发光反应的基本条件•发光反应必须满足以下条件发光反应必须满足以下条件 1. 1. 化学反应必须产生足够的化学能化学反应必须产生足够的化学能•化学发光基于化学反应提供足够的能量化学发光基于化学反应提供足够的能量 A + B → C* +D A + B → C* +D 产物接受反应能被激发产物接受反应能被激发 C* → C + h C* → C + h  •在可见光区观察化学发光，需在可见光区观察化学发光，需170~300kJ170~300kJ··molmol-1-1激发能。

激发能具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求具有过氧化物中间产物的氧化还原反应可满足要求化学反应多是在有化学反应多是在有O O3 3、、H H2 2O O2 2等参加的氧化还原反应中等参加的氧化还原反应中 2. 2. 要有有利的化学反应历程要有有利的化学反应历程 3. 3. 处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返处于激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态回基态•（二）化学发光效率和发光强度•1 1、化学发光效率、化学发光效率 CLCL激发态分子的化学效率化学效率发光效率发光效率三、化学发光反应类型三、化学发光反应类型•1、直接化学发光和间接化学发光（（1 1）直接化学发光）直接化学发光A + B → C* +DA + B → C* +D C* → C + h C* → C + h  产物接受反应能被激发产物接受反应能被激发（（2）间接化学发光A + B → C* +D C* +F→ F* + E F* → F + h  C*:能量给予体 F:能量接收体例：罗丹明B-没食子酸的乙醇溶液测定大气中的O3 没食子酸+O3 →A*+O2 A*+罗丹明B →罗丹明B*+B 罗丹明B* →罗丹明B + h  max＝584nm2.气相化学发光————广泛应用于大气污染监测广泛应用于大气污染监测、可监测空气中的、可监测空气中的O O3 3；；NONO、、NONO2 2；；SOSO2 2；；H H2 2S S；；COCO；乙烯等。

乙烯等•在气相中在气相中O O3 3能氧化能氧化NONO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化氧化NONO、、SOSO2 2、、COCO等产生化学发光等产生化学发光 例例1 1：： NO + ONO + O3 3 → NO → NO2 2* + O* + O2 2 NO NO2 2* → NO* → NO2 2 +h+h  （（ ≥≥600nm600nm）） 常温下产生化学发光，灵敏度可达常温下产生化学发光，灵敏度可达1ng1ng··mLmL-1-1测定测定范围范围0.01~10000 0.01~10000  g g··mLmL-1-1 例例1 1：： CO + OCO + O（原子氧）（原子氧） → →COCO2 2* * COCO2 2* → CO* → CO2 2 +h+h  （（ =300~500nm=300~500nm）） 灵敏度为灵敏度为1ng1ng··mLmL-1-13. 3. 液相化学发光液相化学发光研究和应用的比较广泛的有：鲁米诺、光泽精、研究和应用的比较广泛的有：鲁米诺、光泽精、 没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等。

没食子酸、洛粉碱、过氧草酸盐等•鲁米诺是最常用的发光试剂鲁米诺是最常用的发光试剂，它可以测定，它可以测定ClCl2 2、、HClOHClO、、ClOClO- -、、H H2 2O O2 2、、O O2 2和和NONO2 2，产生化学发光反应，产生化学发光反应时量子效率为时量子效率为0.01~0.050.01~0.05•鲁米诺（鲁米诺（3 3 ––氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中氨基苯二甲酰环肼）在碱性溶液中和和H H2 2O O2 2等氧化剂反应生成最大波长为等氧化剂反应生成最大波长为425 nm425 nm的光的光辐射辐射 425 nm425 nm•反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处反应产生的化学能被产物氨基邻苯二甲酸根吸收，处于激发状态，返回基态时发射荧光于激发状态，返回基态时发射荧光• 可检测低至可检测低至1010-9-9 mol mol··L L-1-1 的的H H2 2O O2 2•四、生物发光体系四、生物发光体系•生物发光是化学发光的一种特殊体系，如水母、细生物发光是化学发光的一种特殊体系，如水母、细菌、真菌、蠕虫还有萤火虫等。

菌、真菌、蠕虫还有萤火虫等•虫荧光素虫荧光素+ATP+O+ATP+O2 2在虫荧光素酶的催化下产生氧虫荧在虫荧光素酶的催化下产生氧虫荧光素光素+ADP++ADP+发光发光•五、电化学发光五、电化学发光•电解质溶液电解反应所产生的光发射称为电化学发电解质溶液电解反应所产生的光发射称为电化学发光•还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽(GSH)(GSH)是一种具有重要生理功是一种具有重要生理功能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨能的活性三肽，它由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸经肽键缩合而成，广泛存在于自然界的生物酸经肽键缩合而成，广泛存在于自然界的生物体内，具有保护血管、抗体内，具有保护血管、抗HlVHlV、保护神经、抗、保护神经、抗惊厥及镇痛等作用惊厥及镇痛等作用•敏度的检测方法的研究仍具有实际意义本工敏度的检测方法的研究仍具有实际意义本工作利用作利用1 1，，8 8一蒽二磺酰胺对一蒽二磺酰胺对Hg2+Hg2+离子的高效离子的高效选择性，通过加入选择性，通过加入GSHGSH与与Hg2+Hg2+络合从而使络合从而使1 1，，8 8一蒽二磺酰胺荧光增强，据此测定一蒽二磺酰胺荧光增强，据此测定GSHGSH。

1 1、实验部分、实验部分•1 1．．1 1仪器仪器•荧光分光光度计，荧光分光光度计，Hitachi FHitachi F一一45004500型，日本日立公司；型，日本日立公司；自动双重纯水蒸馏器，自动双重纯水蒸馏器，SZ-93SZ-93型，上海亚荣生化仪器厂；型，上海亚荣生化仪器厂；酸度计，酸度计，pHpH孓孓2525型，上海雷磁仪器厂型，上海雷磁仪器厂•1 1．．2 2 实验原理实验原理•1 1，，8 8一蒽二磺酰胺一蒽二磺酰胺( (以下简称磺酰胺，简写以下简称磺酰胺，简写ASA)ASA)具有较具有较强的荧光，加入强的荧光，加入HgHg2+2+离子后，离子后，HgHg2 2十十与磺酰胺络合使其与磺酰胺络合使其荧光猝灭当向荧光猝灭当向HgHg2+2+一一ASAASA体系中加入谷胱甘肽体系中加入谷胱甘肽(GSH)(GSH)时，时，GSHGSH中的巯基中的巯基( (一一SH)SH)与与HgHg2+2+络合，释放出与络合，释放出与H H矿矿+ +结结合的磺酰胺而使体系的荧光增强，据此达到测定合的磺酰胺而使体系的荧光增强，据此达到测定GSHGSH含含量的目的，原理见图量的目的，原理见图1 1。

•1 1．．3 3实验方法实验方法•1 1．．3 3．．1 1发射光谱的扫描发射光谱的扫描•分别向三支分别向三支EPEP管中加入管中加入1 1．．5858××10-5 mol/L10-5 mol/L磺酰胺溶液磺酰胺溶液100100微升，然后向第二支微升，然后向第二支EPEP管中加入管中加入3 3．．9494××1010-4-4 mol/Lmol/L的的HgHg2+2+溶液溶液5 5微升，向第三支微升，向第三支EPEP管中加入管中加入3.94 3.94 x10x10-4-4 mol mol··L L-1-1的的HgHg2+2+溶液溶液5 5微升和一定量的微升和一定量的GSHGSH溶液分别用分别用pH6pH6．．5 5的的NaNa2 2HP0HP04 4一一NaHNaH2 2P0P04 4缓冲液定容到缓冲液定容到1 1 mLmL，，放置放置5 min5 min后，在激发波长为后，在激发波长为250 nm250 nm，激发和发射狭缝，激发和发射狭缝宽均为宽均为5 5．．o nmo nm下，扫描发射光谱下，扫描发射光谱•最佳激发波长：最佳激发波长：250nm250nm；最佳发射波长：；最佳发射波长：460nm460nm 2 2结果与讨论结果与讨论•2 2．．1 1 缓冲溶液及其缓冲溶液及其pHpH的选择的选择•在最佳激发波长下，考察了不同在最佳激发波长下，考察了不同pHpH值的值的NaNa2 2 HPOHPO4 4一一NaHNaH2 2 P0 P04 4、、TrisTris——HClHCl等缓冲溶液对等缓冲溶液对ASAASA——HgHg2+2+一一GSHGSH体系荧光强度的影响。

结果表体系荧光强度的影响结果表明：以明：以pH 6pH 6．．5 5的的NaNa2 2 HPO HPO4 4 一一NaHNaH2 2 P0 P04 4缓冲溶缓冲溶液作介质，体系的荧光强度变化最明显，所以液作介质，体系的荧光强度变化最明显，所以选择在选择在pH 6pH 6．．5 5的的NaNa2 2 HPO HPO4 4 一一NaHNaH2 2 P0 P04 4缓冲溶缓冲溶液中测定液中测定•2 2．．2 Hg2 Hg2+2+浓度的选择浓度的选择•HgHg2+2+的浓度对测定的灵敏度影响较大，因此考的浓度对测定的灵敏度影响较大，因此考察了察了Hg Hg 2+2+的浓度对磺酰胺溶液荧光强度的影响，的浓度对磺酰胺溶液荧光强度的影响，结果见图结果见图2 2•2 2．．3 3反应时间的选择反应时间的选择•当向当向ASAASA中加入中加入HgHg2+2+时，体系的荧光强度迅速降到最低，时，体系的荧光强度迅速降到最低，说明说明ASAASA与与Hg Hg 2+2+反应迅速而当加入谷胱甘肽时，由反应迅速而当加入谷胱甘肽时，由于存在竞争反应，荧光逐渐增强，见图于存在竞争反应，荧光逐渐增强，见图3 3。

由图由图3 3可看可看出，当反应进行出，当反应进行6min6min时，荧光强度达到最大稳定值，时，荧光强度达到最大稳定值，所以选反应时间为所以选反应时间为6 min6 min•2 2．．4 4检测谷胱甘肽的线性范围及检测限检测谷胱甘肽的线性范围及检测限•考察了荧光强度的增强值与考察了荧光强度的增强值与GSHGSH浓度之间的关系见图浓度之间的关系见图4 4谷胱甘肽的存在，夺取了和磺酰胺络合的谷胱甘肽的存在，夺取了和磺酰胺络合的Hg Hg 2+2+由图4 4可看出，随着可看出，随着GSHGSH浓度不断增大，体系荧光信号逐渐浓度不断增大，体系荧光信号逐渐增强荧光强度的增加值与增强荧光强度的增加值与GSHGSH的浓度在的浓度在5 5．．0 0××1010-5-5～～5 5．．O O××1010-4-4molmol．．L L-1-1范围内呈线性关系，线性方程是范围内呈线性关系，线性方程是△△F=7F=7．．768 66 C 768 66 C ( (GsHGsH) )／／(10(10-5-5 mol mol··L L-1-1)+3)+3．．8430184301，，相关系数相关系数y y是是O O．．99l 8499l 84。

对空白溶液进行对空白溶液进行1111次平行测次平行测定，根据定，根据3 3倍于噪声的信号计算，其检测限为倍于噪声的信号计算，其检测限为4 4．．1616××1010-6-6 mol mol．．L L-1-13 3 结论结论•利用Hg2+离子猝灭磺酰胺的荧光，通过GSH还原荧光的方法来快速测定GSH的含量实验结果表明该方法简便快速，灵敏度高，可用于实际样品中谷胱甘肽的测定。