生物化学实验-蔗糖酶活力测定.ppt

实验四四 蔗糖蔗糖酶活力活力测定定￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿————3.5－二硝基水－二硝基水杨酸法酸法一、一、实验目的和要求目的和要求1、掌握、掌握酶活力活力测定的基本原理和方法；定的基本原理和方法；2、学、学习酶的比活力的的比活力的计算二、二、实验基本原理基本原理￿￿￿￿￿￿￿￿蔗糖蔗糖酶（（β-D-呋喃型果糖苷喃型果糖苷-果糖水解果糖水解酶EC 3.2.1.26），是一种水解），是一种水解酶它能催化非它能催化非还原性双糖（蔗糖）的原性双糖（蔗糖）的1,2－糖苷－糖苷键裂解，将裂解，将蔗糖蔗糖水解水解为等量的等量的葡葡萄糖萄糖和和果糖果糖（（还原糖）因此，原糖）因此，每水解每水解1mol蔗糖，就能生成蔗糖，就能生成2mol还原糖原糖还原糖的原糖的测定有多种方法，例如：定有多种方法，例如：纳尔逊－索模吉（－索模吉（Nelson-Smogyi））试剂比色法，斐林比色法，斐林试剂法等￿￿￿￿￿￿￿￿本本实验采用采用3.5－二硝基水－二硝基水杨酸法酸法测定定还原糖的含量，由此可得出蔗糖原糖的含量，由此可得出蔗糖酶水解速度其原理是水解速度其原理是3.5－二硝基水－二硝基水杨酸与酸与还原糖共原糖共热被被还原成棕原成棕红色的氨基色的氨基化合物，在一定范化合物，在一定范围内内还原糖的量和反原糖的量和反应液的液的颜色深度成正比。

因此可利用色深度成正比因此可利用分光光度分光光度计在在520nm进行比色行比色测定，求得定，求得样品中的含糖量此法操作品中的含糖量此法操作简便、便、迅速、迅速、杂质干干扰较小蔗糖蔗糖酶活力活力单位位(u)：：￿￿￿￿￿￿￿￿蔗糖蔗糖酶在在50℃℃, pH4.5的条件下，的条件下，每分每分钟水解水解产生生1mg葡萄糖葡萄糖所需的所需的酶量量蔗糖蔗糖酶比活力的比活力的计算：算：￿￿￿￿￿￿￿￿酶的比活力的比活力————为每毫克蛋白每毫克蛋白质所具有的所具有的酶活力活力单位数，一般用位数，一般用酶活力活力单位位/mg蛋白蛋白质表示酶的比活力在的比活力在酶学研究中用来衡量学研究中用来衡量酶的的纯度，度，对于同于同一种一种酶来来说，比活力越大，，比活力越大，酶的的纯度越高利用比活力的大小可以用来比度越高利用比活力的大小可以用来比较酶制制剂中中单位位质量蛋白量蛋白质的催化能力，是表示的催化能力，是表示酶的的纯度高低的一个重要指度高低的一个重要指标￿ ￿￿￿￿￿￿￿￿￿比活力比活力————酶的的总活力活力单位数除以位数除以总蛋白蛋白mg数数，即每，即每mg蛋白所含有的蛋白所含有的酶活力活力单位数￿￿￿￿￿￿￿￿比活力＝活力比活力＝活力单位位/mg蛋白蛋白三、三、实验材料与材料与试剂1、、实验材料材料￿￿￿￿蔗糖蔗糖酶样品品ⅠⅠ、、ⅡⅡ、、ⅢⅢ、、ⅣⅣ2、、实验试剂①￿①￿3,5－二硝基水－二硝基水杨酸酸试剂；；￿￿￿￿￿￿￿￿甲液：溶解甲液：溶解6.9g 结晶酚于晶酚于15.2ml 10％％NaOH溶液中，并用水稀溶液中，并用水稀释至至69ml,在此溶液中加在此溶液中加6.9g亚硫酸硫酸氢钠。

￿￿￿￿￿￿￿￿乙液：称取乙液：称取255克酒石酸克酒石酸钾钠加到加到300ml 10%NaOH溶液中，再加入溶液中，再加入800ml 1%3,5-二硝基水二硝基水杨酸溶液酸溶液. 甲甲,乙二溶液相混合即得黄色乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中于棕色瓶中备用用,在室温放置在室温放置7-10天以后天以后使用￿￿￿￿￿￿￿￿②￿②￿1g/L葡萄糖葡萄糖标准溶液准溶液(葡萄糖相葡萄糖相对分子量分子量198.17））；；③￿③￿5％蔗糖溶液；％蔗糖溶液；④￿④￿0.2mol/L乙酸乙酸缓冲液，冲液，pH4.5；；四、四、实验器材与器材与仪器器1、恒温水浴（、恒温水浴（25℃℃、、100℃℃）；）；2、可、可见光分光光度光分光光度计、、1cm玻璃比色皿；玻璃比色皿；3、、试管、管、试管架；管架；4、移液管；、移液管；5、微量移液器：、微量移液器：200μlμl、、￿ ￿1000μlμl；；；；五、五、实验操作方法和步操作方法和步骤(一一) 蔗糖蔗糖酶活力的活力的测定定1、、标准曲准曲线的制作的制作￿￿￿￿￿￿按下表加操作：按下表加操作：￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿￿以以还原糖（原糖（mg数）数）为横坐横坐标，，A520值为纵坐坐标，制作葡萄糖，制作葡萄糖浓度－吸光度－吸光值标准曲准曲线。

￿￿￿￿1 12 23 34 45 56 67 71g/L1g/L葡萄糖标准溶液（葡萄糖标准溶液（mlml）） 0.00 0.00 0.200.200.30 0.30 0.40 0.40 0.50 0.50 0.600.600.700.70H H2 2O O （（mlml）） 2.0 2.0 1.801.801.701.701.601.601.501.501.401.401.301.303.53.5－二硝基水杨酸－二硝基水杨酸 (ml) (ml) 1.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.01.0 将各管溶液混匀后，在将各管溶液混匀后，在100℃100℃恒温水浴加热恒温水浴加热5 5分钟，分钟， 取出立即用冷水冷却至室温取出立即用冷水冷却至室温 H H2 2O O（（mlml））7 77 77 77 77 77 77 7 将各管溶液混匀将各管溶液混匀A A520520样 品空白I(1:150I(1:150稀释稀释) )Ⅱ(1:150Ⅱ(1:150稀释稀释) )Ⅲ(1:100Ⅲ(1:100稀释稀释) )Ⅳ(1:10-30)Ⅳ(1:10-30)编 号1 12 23 34 45 56 67 78 89 910101111121213130.2mol/L乙酸缓冲液(ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5H2O(ml)1.01.00.950.950.80.80.50.50.950.950.80.80.50.50.950.950.80.80.50.50.950.950.80.80.50.5蔗糖酶液(ml)0.00.00.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.50.050.050.20.20.50.55％蔗糖溶液 (ml)0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5保温时间立即混匀后，立即混匀后，5050℃℃ 保温保温1010分钟，分钟，用冷水冷却至室温用冷水冷却至室温3.5－二硝基水杨酸试剂(ml)1 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 11 1在在100℃100℃恒温水浴恒温水浴中加热中加热5 5分钟分钟, ,用冷水冷却至室温用冷水冷却至室温蒸馏水7 77 77 77 77 77 77 77 77 77 77 77 77 7混匀A5202、蔗糖、蔗糖酶的的酶活力活力测定定按下表加按下表加样：：体 积(ml)蛋白浓度(mg/ml)总蛋白(mg)活 力(u/ml)总活力u比活力u/mg样品Ⅰ样品Ⅱ样品Ⅲ样品Ⅳ（二）（二）实验结果果￿ ￿1、蔗糖、蔗糖酶活力和比活力的活力和比活力的计算：算：￿ ￿2、蔗糖、蔗糖酶各步各步纯化化样品的品的纯度比度比较六、六、结果分析果分析讨论七、注意事七、注意事项1、、酶活力活力测定定时，要控制好反，要控制好反应时间，各管的，各管的酶反反应时间一定要一致，否一定要一致，否则会影响整体会影响整体结果。

果2、加各反、加各反应试剂的体的体积一定要准确，否一定要准确，否则也会影响最也会影响最终结果下下￿ ￿次次￿ ￿实￿ ￿验蔗糖蔗糖酶分离分离纯化化产物的物的SDS－－PAGE检测分分析析￿￿￿￿￿￿及蛋白及蛋白质相相对分子分子质量量测定定 。