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甲基化的检测方法与临床应用摘要】DNA甲基化是表观遗传修饰最基本的方式，在维持正常细胞功能、胚胎发 育和肿瘤发生、动脉粥样硬化中起着重要的作用,是当前学术研究的重点和热点 随着研究的深入,各种各样的甲基化检测方法被开发出来同时在临床应用也初见端 倪，甲基化的深入研究必将对人类健康产生深远的影响关键词】表观遗传DNA甲基化PCR检测重亚硫酸盐单亲遗传病肿瘤动脉 粥样硬化 老化DNA甲基化是一种重要的遗传外修饰,是表观遗传学(epigenetics)的重要组成部 分［1］甲基化是指由DNA甲基转移酶介导,在胞嘧啶的第5位碳原子上加上一甲 基基团，使之变成5-甲基胞嘧啶(5-mC啲化学修饰过程它参与了动物胚胎发育、 基因印迹、 X 染色体失活等过程,在基因表达的调控中具有重要作用基因组正常 甲基化模式改变与某些遗传病和肿瘤［2］以及动脉粥样硬化性［3］有着密切相关性 本文就目前常用的甲基化检测方法和临床应用予以综述1 基因甲基化的检测方法1.1 高效液相色谱柱Kuo等首次报道高效液相色谱柱(HPLC)，它能够定量测定基因组整体甲基化水 平，其过程是:用酸或酶将DNA裂解为五类单核苷酸(包括5-mC)。

因五类核苷酸在 极性溶液中的溶解度不同,在经过非极性的过滤柱时,出柱时间也不同,用波长 260 nm 的紫外光测定流出液的吸收峰并定量此法灵敏度高，是目前测定基因组 DNA中5-mC总量最标准的方法,但不能了解甲基化的位置和状态信息且对DNA纯 度要求较高1.2特异性位点的DNA甲基化的检测1.2.1甲基化敏感性限制性内切酶-PCR/Southern法甲基化敏感性限制性内切酶(methylatio n-se nsitiverestri ctio nendon uclease MS- RE)-PCR/Southern 方法利用甲基化敏感性限制性内切酶对甲基化区的不切割的特 性，将DNA消化为不同大小的片段后再进行分析常用的酶有HpaU-Msp I (识别 序列CCGG)其中Hpa口和Msp I均能识别CCGG序列,然而当序列中的胞嘧啶发生 甲基化时,Hpa口不切割，利用Hpa口-Msp I的这种属性处理DNA,随后进行Southern 或PCR扩增分离产物，明确甲基化状态⑷其优点是可同时检测基因组内多个CpG 位点，实验结果易解释，成本低廉缺点是:①由于CG不仅仅限于CCGG序列中，因 此非该序列中的CG将被忽略;②只有检测与转录相关的关键性位点的甲基化状态 时，该检测方法的结果才有意义;③需要样本量大;④存在酶消化不完全引起的假 阳性的问题;⑤不适用于混合样本。

1.2.2 直接测序法直接测序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化的方法过程是:重亚硫酸 盐使DNA中未发生甲基化的胞嘧啶脱氨基转变成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持 不变，用不含任何CpG位点的引物行PCR扩增扩增后尿嘧啶全部转化成胸腺嘧 啶，对PCR产物进行测序并且与未经处理的序列比较，根据缺失条带判断CpG位点 是否发生甲基化此方法是一种可靠性及精确度高的方法,能明确目的片段中每一 个CpG位点的甲基化状态，但需要大量的克隆测序,操作过程繁琐且费用昂贵1.2.3甲基化特异性的 PCRHerman 等［5］在重亚硫酸盐处理的基础上提出了甲基化特异性的PCR(methylation-specific PCR,MS-PCR)，它将DNA先用重亚硫酸盐处理，随后行引物 特异性的PCR用针对甲基化DNA链的引物能扩增出片段则为甲基化;用针对非 甲基化DNA链的引物能扩增出片段则为非甲基化,由此明确待测序列中CpG位点 是否存在甲基化这种方法的优点是:①避免了使用限制性内切酶及相关问题;② 敏感性高;可用于石蜡包埋样本［6］缺点是:①引物设计要求高，可靠的MS-PCR引 物需设计包含2个或多个完全甲基化或非甲基化CpG位点，由此限制了 MS-PCR的 使用;②这种方法只能作定性研究，不能作定量检测;③存在重亚硫酸盐处理不完 全导致的假阳性。

1.2.4Methylight臼ds等［7］报道Methylight是一种基于Taqman探针的甲基化特异性定量PCR 技术与MS-PCR不同的是加入了 Taqman探针,探针的5'端连接报告荧光,3'端连 接淬灭荧光如果探针能够与DNA杂交，则在PCR用引物延伸至探针时,TaqDNA 聚合酶5'到3'端的外切酶活性会将探针序列5'端的报告荧光切下,3'端淬灭荧光不 再抑制 5'端报告荧光,报告荧光发光,测定报告荧光的强度即可得到该位点的甲基 化情况及水平;高敏感、快速是本方法最显著的特点,此外该法具备可重复、所需 样本量少、不需要电泳分离的特点,可以为临床样本的研究提供可靠的技术支持 缺点是费用高,测定每个位点都要用一对引物和探针,受较多因素影响1.2.5 DNA微阵列法Yan等⑻将以分子杂交为基础的微阵列技术应用于DNA甲基化检测中，具体方 法是：首先对待研究片段用重亚硫酸盐处理，再行PCR扩增，其产物的3'端用荧光 素标记然后与5'端固定于玻璃板上的GC的探针或AC的探针杂交、扫描探针的 荧光信号强度与M/M+U值(M表示甲基化,U表示非甲基化)存性关系［9］该 法可用于多样本、多位点甲基化的检测,样本需要量少,适于临床样本,但不能得到 每个 CpG 位点的信息,且探针可能存在交叉杂交,致结果假阳性,影响分析。

1.2.6 MS-MLPAMS-MLPA(methyla tion-specificmultiplex liga tion-depe nden probe amplifica tion)是 Nygren等［10］在MLPA［11 ］基础上改进后提出的用于检测特异位点甲基化的方法 具体过程:应用MS-MLPA探针(探针的靶基因识别序列中一定要包含一个甲基化敏 感的酶限制位点)和标本DNA进行杂交使之结合形成DNA-探针复合物，并用连接 酶将探针连接，然后，加入甲基化敏感限制性内切酶(如Hhal)，若含有的位 点存在甲基化，则Hha I不切割，探针顺利连接,随后的PCR照常进行反之则不能， 最后根据扩增片段明确定靶基因的甲基化情况这种方法的优点是:①需要样本 的数量少，由于探针具有非常短的识别序列，因此MPLA可以用于局部降解的DNA, 如石蜡包埋的DNA样本;②可用于分析大量混合样本，可一次检测多个靶基因中 CpG 位点的甲基化情况缺点是探针连接位点受限制性内切酶位点识别的限制,且 要考虑到所用酶的反应适宜温度2 DNA甲基化与临床应用2.1 单亲遗传病 单亲遗传病是指由非孟德尔遗传方式引起的人类的遗传病。

该病的发生与双亲遗传的等位基因发生差异甲基化区域有关，正常情况下是不发 病的，但是等位基因中非甲基化一方这段本来应有活性的基因片段出现异常或未 能完整地遗传给子代,则会引起一系列人类疾病主要有:贝克威思-威德曼综合征 (Beckwith-Wiedema nn Syn drome,BWS),普拉德威利综合征(Prader-WilliSy ndrome, PWS)，安格曼综合征(A ngelman syn drome,AS)和特纳综合征(T URNER,TS)等2.2 肿瘤 肿瘤的早期诊断，治疗以及预后评价一直是医学的关注焦点肿瘤 细胞DNA总体甲基化水平低于正常细胞，但某些特定基因(如肿瘤抑制基因)CpG岛 却处于高甲基化状态［12］由于细胞转化过程中的甲基化现象早于明显的恶性表 型出现，甲基化研究可以为肿瘤的早期诊断提供生物学标记，同时DNA甲基化是 一种不改变DNA 一级结构可逆的表观遗传修饰，纠正异常的甲基化状态成为治疗 肿瘤的一种新策略甲基化改变与传统的预后指标之间也存在密切联系[13]2.3动脉粥样硬化智艳芳等[14]首次报道动脉粥样硬化(AS)病人低密度脂蛋 白受体(LDL-R)基因启动子区出现显著增高的甲基化修饰度。

AS患者雌激素受 体-a (ER-a)基因启动子区CpG岛出现高度甲基化，且甲基化程度与血同型半胱 氨酸(tHcy)浓度呈正相关高Hey血症很可能通过干扰ER-a基因的甲基化而促 进 AS 的发生、发展这为心脑血管病的发病机理提供了进一步的理论支持2.4老化随着年龄的老化，基因组总体DNA甲基化水平逐渐降低这一甲基化 水平的变化,是否仅与老化有关,还是也参与老化过程中的肿瘤高发,尚有待进一步 研究3 结语DNA 甲基化的研究有许多方法,在选择时首先需要考虑的是待测对象是特定基 因还是基因组由于各种方法各有其优缺点,准确的基础研究和临床筛查对所需方 法的要求亦不一样本文所介绍的方法，希望对于DNA甲基化的研究有所帮助 同时疾病的去甲基化实验性治疗已经在有条不紊地进行，相信在不久的将来在人 们完全认识其安全性的基础上，基因甲基化对疾病的预测、检测、治疗和预后判 断开辟另一条广阔的天地参考文献[1] Wu C T,Morris J R.Genes,genetics and epigenetics:acorrespondence[J].Science,2001,293:1103- 1105.[2] Tycko B. Epigenetic gene silencing in cancer[J]. J Clin Invest,2000,105(4):401-407.[3] 智艳芳,黄彦生,李著华,张瑞明,王树人.动脉粥样硬化病人雌激素受体基因的甲基化与高同 型半胱氨酸血症关系的研究[J].卫生研究,2008,(03):314-317.[4] 黄琼晓，金帆，黄荷凤.DNA甲基化的研究方法学[J].国外医学遗传学分册，2004,27(6):354- 358.[5] Herman J G,Graff J R,Myohanen S,et al.Methyla- tion-specific PCR:a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J].Proc Natl Acad Sci USA, 1996,93(18):9821-9826.[6] Yang B, Guo M, Herman J G,et al. Aberrant promoter methylation profiles of tumor suppressor genes in heaptocellular carcinoma[J]. Am J Patho,l2003,163(3):1101-1107.[7] EadsCA, DanenbergKD, KawakamiK, et a.l Methy-Light: a high-throughput assay to measure DNA methylation[J]. Nucleic Acids Res, 2000, 28(8):E32.[8] Yan P S, Chen C M, ShiH,et al. Dissecting comples epigenetic alterations in breast carcinoma using CpG island microarrays[ J].carcinomaRes,2001,61(23):8375-8380.[9] Brown CJ, Carrel L, Willard HF. Expression of genes from the human active and inactive X chromosomes. Am J Hum Genet, 1997,60:1333-1343.[10] Nygren A O, Ameziane N, Duarte H M,et al.Methylation-specific MLPA(MS-ML。