Elisa实验药品步骤及相关材料.doc

本实验室Elisa所需试剂器材1. 试剂(1)包被缓冲液碳酸盐缓冲液(PH9.6 0.05M)：Na2CO3 1.59gNaHCO3 2.93g 加蒸徭水至1000ml作用：稀释抗原(菌悬浮液)⑵ 洗涤缓冲液PBST (PH7.4 0.15M)：KH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O 2.9gNaCl 8.0gKC1 0.2gTween-20 0.05% 0.5ml加蒸懈水至1000ml作用：洗涤(3) 缓冲液 PBS (PH7.4 0.15M)：KH2PO4 0.2gNa2HPO412H2O 2.9gNaCl 8.0gKC1 0.2g加蒸徭水至1000ml作用：制备封闭液(4) 封闭液：牛血清白蛋白(BSA)O.lg,加缓冲液(PBS)至100ml或PBS加2%BSA 作用：封闭空隙(5) 稀释液：PBST加1 %牛血清口蛋口(BSA)作用：稀释抗体及酶标抗体(5)HRP羊抗兔IgG 一酶标抗体 作用：结合抗体(6) 底物缓冲液磷酸盐柠檬酸(PH5.5):0.2M Na2HPO4(28.4g/L) 25.7ml0.1M 柠檬酸(19.2g/L) 24.3ml蒸僻水50ml作用：制备TMB(7) TMB(四甲基联苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml 无水乙醇)0.5ml底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75 %氏。

2 32pl作用：显色(8) 终止液(2M H2SO4)：蒸係水178.3ml,逐滴加入浓硫酸(98%)21.7ml 作用：终止反应2. 器材：聚苯乙烯塑料板(酶标板)96孔抗原制备：以平板划线法将供试菌菌接种于普通营养琼琼脂培养棊上，28 C培养24 h后，挑取单菌落 接种于LB液体培养基中,过夜培养；5 000 r min-1离心10 min,弃上清;加入1%的甲醛 于37 C灭活24 h,通过菌落涂布法检测灭活效果;5 000 r min1离心10 min,弃上清,用 麦氏比浊法，配制出浓度约为lxlocells-mL4的菌悬液作为免疫抗原抗血清制备：抗血清不能直接川于包彼，应先提取IgG大量工作表明，只川硫酸鞍沉淀就nJ以得到足够 纯度及高活性的IgG蛋口其基本步骤如2(1) 取抗血清0.2 ml；(2) 加生理盐水(0.85% NaCl) 0.3 ml,混匀；⑶逐滴加入饱和(NH4)2SO4 0.5 ml,充分振荡混匀，4C静置1 h；⑷ 10000 rpm/min 离心 20 min,弃上清；(5)加0.5 ml牛理盐水重悬浮，混匀；⑹0.25 ml饱和(NH4)2SO4,充分振荡混匀，4C静置1 h；(7) 10000 rpm/min 离心 20 min,弃上清;⑻重复5〜8步骤一次；(9) 加生理盐水0.5 ml垂悬浮，混匀；(10) 生理盐水中透析12—24 h；(11) 在0.2 M pH 9.0硼酸缓冲液透析12〜24 h；(⑵ 分装，即将使用时4C保存，备用・2(rc保存。

为最大限度保持抗体活性，整个过程应在4c下进行対于冻干抗血清或长时间保存的血清, 将牛理盐水透析改为3 M KCNS透析，促使聚合的多聚体解聚硫酸钱法纯化血清IgG粗品：取1份血清加入1份生理盐水进行稀释，边搅拌边加入2倍原 血清体积的饱合硫酸镀，室温放置30min, 7 OOOr / min离心30min;沉淀溶于原血清体积的生 理盐水中，加入1倍体积的饱合硫酸鞍，室温放置30min,重复第二步，将沉淀溶于1/ 10原 血清体积的生理盐水溶液中，在0.0175mol/LpH6. 3PB缓冲液中透析至无NH軒为止免疫血清效价的测定：采用试管凝集法测定抗血清的效价ELISA检测流程：用pH 9.6的0.05 mol/L碳酸盐缓冲液稀釋抗原，加入96孔聚苯乙烯酶标反M板孔内，每孔 100 pL, 60 C烘干，用PBST缓冲液(注满孔)洗涤3次；每孔加入300 pL2%BSA・PBST 封闭液，37 C封闭1 h, PBST缓冲液洗涤3次；每孔加入100 pL适当稀释的阳性血清和阴 性血清,37 C反应1 h, PBST缓冲液洗涤3次;每孔加入100 |1L的羊抗兔IgG-HRP酶标 抗体,37 C反应lh： PBST缓冲液洗涤3次;加新配制的TMB-H2O2底物溶液(临用15 分钟内)，每孔100 |iL, 37 C避光反应20min；以50 |.iL 2 mol-L-1 H2SO4终止反应；15分钟 内用酶标检测仪读取OD450值，以判定结果。

抗原授佳包被浓度和免疫血清最适稀释度的确定：棋盘法:将lxlO9CFU/mL的菌体悬液梯度稀释至1x105CFU / mL,使抗血清做1:2000、1：5000、1 : 10 000、1 : 15 000、1 : 20 000稀释酚标抗体做1： 1000稀释，每个稀释度包被 3个孔，进行间接EL1SA测定以能产牛OD450值为1.0左右，且P / N值最大的为抗原 抗体最佳稀释度酶标二抗最适稀释倍数确定：在确定的抗原抗体最佳工作浓度下,将酶标二抗稀释为1： 1000、1： 2000、1： 5000、1： 10000、 1： 20000 5个稀释比试验，依据其OD450值在1.0左右的选择为最佳二抗稀释比，且P/ N值最大为最佳稀释度硼酸缓冲液一般PH6.77〜9.24A 液：0.2moVL 硼酸 0.05mol/L NaCI配方：硼酸:1.2368g, NaCI 0.2925g,加蒸憾水至100mlB液：0.05mol/L硼酸钠配方：硼酸钠1.907g,加蒸饰水至100ml不同的PH值配方如下：PHA(ml)B(ml)PHA(ml)B(ml)6.779.70.38.415.54.57.099.40.68.515.05.57.369.01.08.604.56.07.608.51.58.694.06.07.788.02.08.843.07.07.947.52.5&982.08.0&087.03.09.111.09.08.206.53.59.240 10.08.316.04.0透析袋使用前处理：1. 把透析袋剪成适当长度(10・20cm)的小段。

2. 在人体积的2%(W/V)碳酸氢钠和lmmol/LEDTA(pH8.0)中将透析袋煮沸10分钟3. 用蒸憎水彻底清洗透析袋4. 放在lmmol/LEDTA(pH &0)中将Z煮沸10分钟5. 冷却后，存放于4度，必须确保透析袋始终浸没在溶液内从此时起取川透析袋是必须 戴手套6. 用丽在透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净透析膜(前处理方法如下)：1. 戴手套把透析膜剪成适当长度，浸在蒸憎水中15 min泡软2. 浸入10 mM碳酸氢钠中，并加热至80C, 一边搅拌至少30 min3. 换到10mMNa2 EDTA中浸泡30 min,以新鲜的EDTA同样方法处理三次4. 再用80C蒸馆水洗30 min,然后换到20%酒精中，放在4C冰箱中保存方法一：1、 把透析袋剪成适当长度(10・20cm)的小段2、 在人体积(500mL)的2% (W/V)的碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA.2Na (pH=8.O)中将透 析袋煮沸lOmino3、 用蒸馆水彻底清洗透析袋4、 放在 500mL 的 1 mmol/L EDTA.2Na (pH=8.O)中将之煮沸 lOmin5、 冷却后，置于30%或者50%的酒精中，放于4C冰箱，必须确保透析袋始终浸没在溶 液内。

从此时起取用透析袋必须戴手套6、 在使用前要用蒸饰水将透析袋里外加以清洗干净说明：透析液的配置：10gNaHCO3 +186.6mgEDTA.2Na + 500mL蒸憎水1 mmol/L EDTA.2Na：即 373.2mg/L方法二：可用沸水煮5至10分钟，再用蒸係水洗净，即可使用方法三：可先用50%乙醇点沸1小时，再依次用50%乙醇、0.01 mol/L碳酸氢钠和1 mmol/L EDTA (pH=8.0)溶液洗涤，最后用蒸憎水冲洗即可使用说明：1. EDTA煮主要是为了除去生产时附着在透析袋上的金属离了2. 透析袋的截留分子量3000kdo使用后的透析袋保存方法：1•用生理盐水浸泡以去掉蛋白，并用蒸懾水清洗干净，然示置于50%乙醇中保存即可；2. 用完以后,耍彻底洗干净，透析袋也nJ以保存在0.1%叠氮钠(可防止微生物生长)里；0.05%・0.1%叠氮钠，或者ImM EDTA,或者50%廿油中4度保存，公司的人建议前两种保 存比较好！3. 使用示的透析袋洗净示可存于4C蒸懈水或者30%乙醇中，确保透析袋始终浸没在溶液内 若长时间不用，可加少NaN2,以防t菌从此时起取用透析袋必须戴手套。

洗净凉干的 透析袋弯折吋易裂口，用时必须仔细检查，不漏吋方可重复使用实验操作：1、取空白酶标板，于每孔中加入纯化蛋白溶液lOOuL，于振荡器上震荡混匀，用封口膜 封盖酶标板，室温包被过後2、 取下封口膜，弃去酶标板内溶液，用洗剂液每孔加入1%BSA封闭液100", 37C封闭lho3、 取下封口膜，弃去酚标板内溶液，用洗剂液 每孔加入一抗血清100", 37C封闭lho4、 取下封口膜，弃去酚标板内溶液，用洗剂液(lxPBST)(lxPBST)(lxPBST)洗剂酶标板5次,洗剂酗标板5次,洗剂酚标板5次,最后一次吸干最后一次吸干最后一次吸干每孔加入酶标二抗兔抗羊IgG-HRP 100叫37C封闭lho最后一次吸干5、 取F封口膜,弃去酶标板内溶液,用洗剂液(lxPBST)洗剂酶标板5次,每孔加底物A 50"和底物B 50|iL,震荡混匀，室温显色10〜15min<>6、每孔加入终止液50",立刻在酚标仪450nm波长一卜读収OD值加样孔 OD值检测血清其他血清阴性血清或未免血清（只加稀释液或未免血清、酶标二抗，底物显色液A、B及终止液）酶空白孔 （只加酶标二抗，底物显色液A、B及终止液）底物空口孔 （只加底物显色液A、B及终止液）纯空白孔 （只加终止液）抗血清的纯化（Purification of antiserum）抗血清纯化的目的是尽量除去抗血清中与目的抗体不和关的成分，以防止抗体外的其他 血清成分对试验结果产牛彩响。

因此只能根据不同目的的要求，从抗血清中除去容易T扰的 有关成分，或提取相应的免疫球蛋白抗血清纯化的方法主要冇粗提法和精制法两个过程粗提法主要常川硫酸钱盐析法，精 制法分非特异性和特异性两种类型非特异性方法如葡聚糖凝胶过滤法、离子交换层析法, 其方法均系基于蛋口质分子的物理性质特界性方法如免疫吸附法，其方法基于抗原抗体的 特异性反应一、盐析法（Salt fractionation）【实验原理】蛋口质在不同浓度的盐溶液中相对溶解度不同，血清丫球蛋口在一定浓度盐溶液中易于沉 淀，而白蛋白则不易沉淀，据此可将二者分离主要试剂与器材】1 •饱和硫酸铉溶液収500ml蒸僧水加热至70〜80C,将400g硫酸鞍溶于其中，搅拌20min, 冷却待硫酸钱结晶。