秦巴硒菇水浸物活性成分对血源细胞的正负调节作用.pdf

上海师范大学硕士学位论文论文题目：秦巴硒菇水浸物活性成分对血源细胞的正负调节作用学科专业：动物学 学位申请人：程呈 指导教师：李兴玉摘要秦巴硒菇( A g a r i c u sb l a z e iM u r r i U ．Q b s g ) 是在我国成功栽培的一种富含硒的食用菌为了研究这一全新食用菌的水溶性成份对血液系统细胞的负调节和正调节作用，分别在4 ℃、2 5 ℃、6 0 ℃、1 0 0 ℃四种不同温度下制备秦巴硒菇水浸物，并作用于早幼粒细胞性白血病细胞( 飚6 2 ) ，以获得作用效果最佳的秦巴硒菇水浸物在研究秦巴硒菇水浸物诱导硒6 2 凋亡的实验中，运用四氮唑蓝比色法( M T T法) 、集落形成计数法、流式细胞检测技术、琼脂糖凝胶电泳法、荧光显微镜、透射电子显微镜以及单细胞逆转录一聚合酶链式反应( I 汀一P C R ) 法等多种方法进行了生物活性、生化检测，形态学观察及凋亡相关基因表达的检测在研究秦巴硒菇水浸物对血源细胞系分化抗原的影响的实验中，采用了本实验室制备的免疫荧光纳米微球( I F N B ) 及F A C S 进行检测在本研究中，还应用M T T 法检测荧光纳米微球对小鼠骨髓细胞、飚6 2 细胞、H e l a 细胞是否具有毒性作用；并应用本实验室制备的磁性纳米粒子直接从细胞裂解液中分离获得提取m R N A 的研究。

实验结果证明，在四个不同温度条件下制备的秦巴硒菇水浸物对K 5 6 2 肿瘤细胞的抑制作用的实验研究中，发现6 0 ℃下制备的秦巴硒菇水浸物效果最佳，与对照组相比，具有显著性差异( P 0 ．0 5 ，说明由于从小鼠体内取出的骨髓细胞为原代细胞，离体后在体外有一定的适应期，因此对F I T C 、R B 2 0 0 荧光纳米微球有一定的敏感度随着培养时间延长、F I T C 、R B 2 0 0 荧光纳米微球浓度的增加，实验组与对照组差异不显著此结果提示，F I T C 、R B 2 0 0 荧光纳米微球对小鼠骨髓细胞无明显毒性作用2 ．4 ．2 ．2 ．2 荧光纳米微球对飚6 2 肿瘤细胞的毒性实验荧光纳米微球浓度( ∥鲈儿)图4 —4F I T C 和R B 2 0 0 荧光纳米微球对K 5 6 2 肿瘤细胞的霉性测定F i g ．4 —41 r o x i c i t yd e t e n n i n a t i o no fK 5 6 2c e l l se 丘e c t e db yF l T Ca n dR B 2 0 0N a n 0 ．F 1 u o r e s c e n c eB e a d s由图4 —4 可知，不同浓度的F I T C 和R B 2 0 0 荧光纳米微球作用K 5 6 2 肿瘤细胞4 8 h ，经酶标仪检测得后吸光值变化不大。

n = 8 ，通过t 检验分析，与对照组比较得知1 ∥g ／m L 、犁g ／m L 及舡∥m L 的F I T C 荧光纳米微球差异不显著，P > 0 ．0 5 ，而即∥m L 的F I T C 荧光纳米微球差异极显著，P O ．0 5 ，由2 乃 ” 毯1 乃 吣 省oL，LQ0c ；上海师范人学硕士学位论文第二章秦巴硒菇水浸物生物活性研究此说明R B 2 0 0 荧光纳米微球对K 5 6 2 肿瘤细胞无毒性2 ．4 ．2 ．2 ．3 荧光纳米微球对H e l a 细胞的毒性实验O1248荧光纳米微球浓度( ∥卧儿)图4 —5F l T C 和R B 2 0 0 荧光纳米微球对H e l a 细胞的毒性测定F i g ．4 —51 r o x i c i t yd e t e n n i n a t i O no fH e l ac e l l se f f c c t e db yF I T Ca n dR B 2 0 0N a n o - I q u o r e s c e n c eB e a d s由图4 —5 可知，不同浓度的F I T C 和R B 2 0 0 荧光纳米微球作用H e l a 细胞4 8 h ，经酶标仪检测后发现与对照组相比吸光值都大于对照组。

n = 8 ，通过t检验分析，与对照组比较得知1 ∥∥m L 、犁∥m L 、舡g ／m L 及即g ／m L 的F l T C和R B 2 0 0 荧光纳米微球差异都极显著，P O ．0 5 ，差异不显著由此说明，F l T C 和R B 2 0 0 荧光纳米微球对小鼠骨髓细胞无明显毒性作用在作用l 为6 2 肿瘤细胞的实验中发现，与对照组比较1 ∥咖L 、犁∥m L 及雏∥m L 的F I T C 荧光纳米微球差异不显著，P > O ．0 5 ，而即g ／m L 的F I T C 荧光纳米微球差异极显著，P 0 ．0 5 ，由此说明R B 2 0 0 荧光纳米微球对K 5 6 2 肿瘤细胞无毒性在作用H e l a 细胞的实验中发现，与对照组比较1 ∥g ／m L 、犁g ／m L 、舡∥m L 及即∥m L 的F l T C 和R B 2 0 0 荧光纳米微球差异都极显著，P < 0 ．0 1 ，但吸光值明显高于对照组，表示细胞在不断生长，说明F I T C 和R B 2 0 0 荧光纳米微球对H e l a 细胞无毒性作用研究结果表明，我们使用的纳米微粒对所研究的3 株靶细胞基本不存在毒性作用，为将来的活体实验提供了可靠的依据。

当然在以后的进一步实验中，我们还会对荧光微球进行动物试验，以求对其安全性作出正确的评估磁性纳米微球是磁分离技术的基础，而现今磁分离在生命科学领域中的应用十分的广泛磁分离技术在细胞生物学中可用于分选纯化干细胞、单核细胞或骨髓和血液中肿瘤细胞的检测等而本研究实验中利用磁性纳米微球对m R N A 进行分离与纯化，这主要体现了其在分子生物学领域的应用【3 5 1 在细胞特定基因表达和调控的研究中，使用磁性纳米微球分离捕获m R N A 后进行逆转录一聚合酶链反应( R T —P C R ) 扩增，是一种强有力的手段【3 6 1 通常一个典型的哺乳动物细胞约含有1 0 ‘缸g R N A ，但是其中8 0 ％～8 5 ％为核糖R N A ( r R N A ) ，主要是2 8 S 、1 8 S 、5 ．8 S 和5 S 四种，剩下的1 5 ％～2 0 ％中大部分由不同的低相对分子质量的R N A 组成，如转运R N A ( t R N A ) 和小核R N A( S n R N A ) 【3 7 1 这些高丰度的R N A 可以通过凝胶电泳、密度梯度离心、阴离子交换层析和高压液相层析分离信使R N A ( m R N A ) 与上述R N A 不同，其含量占R N A 总量的1 ～5 ％，其无论大小还是核苷酸序列都是不同的，其长度从几百第二章秦巴硒菇水浸物生物活性研究上海师范人学硕士学位论文个碱基到几千个碱基不等。

但是，大多数真核m R N A 分子的3 ’端存在着一个2 0 ～2 5 0 个的多聚腺苷酸残基p 0 1 y ( A ) 因此，利用这一特性，我们在磁性纳米微球界面上修饰巯基( 一S H ) ，再在0 1 i g o ．d T 寡核酸的5 ’端修饰一S H ，两者经过一定条件的处理后，可形成二硫键用此分离器能直接从细胞裂解液中分离得到的m R N A ，即可获得一定量的目标m R N A ，用于扩增基因在本实验中，选用了在真核细胞中丰度较高的p ．a c t i n 基因作为评估分离m R N A 的效果我们对分离的目标基因通过I 盯一P C R 实验后，经凝胶分析仪观察发现能够有效地扩增出B ．a c t i n基因，在5 6 4 b p 处出现了明晰可见的条带与使用R N 筋s oR e a g e n t 的传统方法抽提总m R N A 经R T —P C R 后扩增出的p a c t i n 基因的条带一致运用磁分离的方法，在外加磁场的作用下能快速有效地从细胞裂解液中直接获得实验所需的m R N A ，无需通过提取总R N A 后再分离得到m R N A 这种耗时的方法，大大缩短了实验时间；而且在整个实验过程中，无需用到酚、氯仿等有毒试剂。

因此使用磁性纳米微球分离m R N A 的方法方便快捷高效，安全易操作，而且经济上海师范大学硕士学位论文第二章秦巴硒菇水浸物生物活性研究§2 ．5结论秦巴硒菇( A g a r i c u sb l a z e iM H r r i l l ．Q b s g ) 是在我国栽培的一种富含硒的全新食用菌我们以秦巴硒菇为研究对象，通过多种实验方法研究这一全新食用菌的水溶性成份对血液系统细胞的负调节和正调节作用在整个研究实验中我们获得了以下的研究成果：2 ．5 ．1 、最佳作用药物的获得：在4 ℃、2 5 ℃、6 0 ℃、1 0 0 ℃四种不同温度下制备秦巴硒菇水浸物，并作用于早幼粒细胞性白血病细胞( 飚6 2 ) ，通过剂量效应和时间效应实验获得作用效果最佳的秦巴硒菇水浸物，即6 0 ℃下制备的秦巴硒菇水浸物并以此作为以下实验的研究对象2 ．5 ．2 、对血液系统肿瘤细胞的负调节作用：通过活性检测、生化指标检测、流式细胞检测、形态学观察、分子机理的探讨等方法证实：6 0 ℃下制备的秦巴硒菇水浸物具有有效诱导飚6 2 肿瘤细胞凋亡的作用，表现出一系列典型的形态学特征，在7 2 h 时作用效果最佳，而且秦巴硒菇水浸物能有效促进凋亡基因p 5 3 、F a s 和C a s p a s e ．3 的表达，对肿瘤的形成具有明显的抑制作用。

2 ．5 ．3 、对正常血液系统细胞的正调节作用：通过我们制备的标记有特定抗体的免疫纳米荧光微球( I N F B ) 并结合流式细胞技术检测证实：6 0 ℃下制备的秦巴硒菇水浸物具有有效地促进人脐血单个核细胞中的造血干细胞向红系、粒系、B 细胞、T 细胞分化以起到调节机体免疫和造血功能的作用2 ．5 ．4 、纳米微球的运用：本实验室制备的免疫荧光微球已属于纳米级通过表面修饰生物活性基团，连接不同抗体后能有效地对所需的不同种类的细胞进行标记，而且还能通过连接药物直接作用靶细胞，引起细胞凋亡通过M T T 比色法证实：本实验室自行制备的荧光纳米微球对动物细胞生长无明显的毒性作用，为今后的活体实验提供依据；通过R T _ P C R 方法证实：我们制备的磁性纳米微球经表面修饰后可从细胞裂解液中直接分离得到m R N A ，并成功扩增出B ．a c t i n基因通过本论文的实验研究结果，我们发现通过低温萃取6 0 ℃获得的秦巴硒菇水浸物中的活性成份具有最佳可以诱导K 5 6 2 肿瘤细胞的凋亡和促进人脐血单个核细胞向不同谱系分化的正负调节功能此种提取抗肿瘤有效成分的方法克服现有的秦巴硒菇有效成分提取方法繁琐、成本昂贵、提取效果差、易造成有效成分第二章秦巴硒菇水浸物生物活性研究上海师范人学硕士学位论文丧失、提取方法复杂不利于大规模工业化生产。

同时本实验室制备的荧光纳米微球对细胞的生长无明显的毒性作用，从而为体内实验提供了研究的前提本实验室制各的磁性纳米粒子能有效地从裂解液中直接分离获得较纯的m R N A ，而且安全易操作，为m R N A 的快速分离纯化提供了条件上海师范大学硕+ 学位论文致谢致谢值此论文结束之际，我衷心的感谢我的导师一李兴玉教授在我研究生生涯中给我的每一份关注、关心和关切在我的研究生学习阶段，李老师时刻给予我无微不至的教育与照顾，从实验研究，科研学习到我生活中的点点滴滴无不渗透着李老师的心血三年来，李老师和蔼可亲的高尚品德，严谨求实的治学态度，锐意创新，全神贯注，永不放弃的学术精神使我终生难忘，受益匪浅如今，我即将毕业，但我将时刻记住您，记住您的每一句谆谆教导，记住您的每一份热切关心，在此我要向我敬爱的导师李兴玉教授表达我最崇高的敬意和深深的感谢我要感谢李利珍教授、杨晓彤教授、徐燕副教授、何其庄教授和俞伟东教授，在我的研究生生涯同样离。