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    关于湿热灭菌工艺的微生物验证讨论    杜海摘 要：本文通過对生物指示剂的选择、验证方法等内容来讨论湿热灭菌工艺的微生物验证Key：湿热灭菌 验证最终产品的无菌质量取决于两个因素，即灭菌前产品中的微生物含量以及灭菌工艺的杀灭效果微生物学验证就是在这两个因素的基础上进行的要用与产品灭菌工艺相适应的最苛刻条件来挑战该产品灭菌工艺的有效性、可靠性和稳定性任何灭菌工艺均应当能使产品中的污染菌含量下降至一个菌后，再下降6个对数单位，这样才能保证产品经灭菌后其中非无菌品的概率不超过1/百万一、热对微生物细胞的效应：湿热灭菌的效应是导致细胞内的关键性蛋白质和酶发生热变性或凝固温度对该破坏性过程起促进作用从微观角度来看，不具备真正核膜结构的原核细胞（如细菌和蓝绿藻）最为耐热一般说来，微生物的耐热性可按下列顺序排列（耐热从高到低）：细菌芽孢>酵母菌及霉菌>革兰阳性细菌>革兰阴性细菌>病毒具备核膜结构的真核微生物，在60℃-80℃就可被迅速杀灭绝大多数细菌的营养细胞在45℃以上就不能生长，80℃-100℃就可被迅速杀灭，但是，某些嗜热细菌甚至可在80℃以上的高温中生存细菌芽孢的耐热性与很多因素有关，芽孢形成时，细菌停止生化反应，并将遗传物质包于芽孢内。

随之进行一系列生物物理变化：细胞质大量脱水并体积减小，然后在缩小的原生质体周围形成一层厚壳此过程中形成了一种名为吡啶二羧酸或DPA（吡啶-2，6-二羧酸）的特殊化学物质芽孢形成阶段，吡啶二羧酸钙与DNA以及细胞内的酶形成复合物，以保护处于恶劣环境中的芽孢芽孢可以在休眠状态下存活多年，一旦条件利于萌发，便可在几分钟内恢复到生长状态二、生物指示剂的选择 ：美国药典对过热灭菌工艺的定义是指能使D值不小于1分钟的微生物至少下降12个对数单位的灭菌工艺对一般的液体产品而言，在121℃灭菌15分钟即被认为过热灭菌工艺但对管路、胶塞、织物以及过滤器等热穿透性较差的物品则需要更长的灭菌时间或更高的灭菌温度，方能达到过热灭菌要求用做生物指示剂的微生物芽孢应具有良好的耐热性并且耐热性也相对比较稳定根据灭菌工艺对微生物的强热至死效应，通常选用D值不低于1.5-3.0分钟的嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢（每个指示剂的芽孢含量通常在105-107之间）作为生物指示剂对过热灭菌工艺进行验证该类指示剂在F0值低于其存活时间（D值×芽孢数的对数-2）时，应当能全部呈阳性结果；当F0值高于其杀灭时间（D值×芽孢数的对数+4）时，所有的生物指示剂均应呈阴性结果。

对F0值为15分钟的灭菌工艺，可选用D值为1.5分钟、芽孢含量为106个的生物指示剂，或其他耐热性相当的生物指示剂，对其进行验证1每单位生物指示剂的芽孢含量1.0×106至5.0×106；2每单位生物指示剂的芽孢含量1.0×106至5.0×107；3每单位生物指示剂的芽孢含量1.0×105至5.0×106；D值指在一定温度下将微生物数量杀灭90%或下降一个对数单位所需要的时间根据被灭菌物品的性质来确认所选用不同包装方式的生物指示剂常用于灭菌工艺验证的生物指示剂主要有三种形式：芽孢条、芽孢悬浮液和自含型安瓿瓶生物指示剂灭菌溶液时，多选用自含型安瓿瓶生物指示剂；灭菌织物时，多选用芽孢条；灭菌管路时，则可能要选用特殊生物指示剂（如用接有芽孢的钢丝、线等）以测试死角处（最冷点）的灭菌状况对一特定的灭菌工艺而言，尽可能购买同一类型的生物指示剂，这样可以大大减少实验室花费在生物指示剂的质量复核及灭菌工艺验证评价方面的工作量三、生物指示剂验证方法：验证时，腔室内的物品应按实际生产时的要求进行装载，生物指示剂的使用数量应足以反映整个物品内、外部的灭菌状况，生物指示剂既要遍布整个腔室，又要尽可能的放在热效应最差的部位，如物品中央、管路拐角以及腔室的排水口等。

应尽可能地将生物指示剂与物理测试用温度探头放于同一位置，以准确获取物理参数与微生物致死性之间的相关性资料，这对偏差分析至关重要放置在每个位置的生物指示剂均应做好标记，并且要与验证文件中生物指示剂的验证分布图相对应验证时，采用相关产品的最低灭菌条件进行灭菌处理灭菌程序结束后将生物指示剂取出并清点数量并确认无误后，送至微生物室，于适当条件下培养检查培养检查时，需要考虑阳性对照以及培养基的灵敏度等关键事项当生物指示剂经受挑战试验后，宜在4小时内培养（有资料提议）但是，从质量保证角度来看，我们应当尽可能的在较短时间内培养经受挑战后的生物指示剂每个企业应根据自身的条件和特点制定适当的时间限度在初始验证阶段，分别用生物指示剂在相同的灭菌条件下至少连续运行3次，以评价灭菌工艺条件的稳定性；在以后的定期再验证中，每次检测一批即可验证时的生物指示剂分布、腔室内的产品装载及指示剂的控制要求均与过热灭菌工艺验证时生物指示剂的使用原则相同四、结果评价：在上述验证条件下，只有连续3次试验的所有结果均合格（均呈阴性）方可证明相应灭菌工艺的可靠性Reference：[1]王彦忠；湿热灭菌工艺的微生物验证2011；08  -全文完-。