林肯链霉菌产林可霉素发酵培养基的优化.doc

表格清单表1-1主要仪器 4表1-2主要试剂 4表2-1种子代谢状况 10表2-2正交试验的因素水平表 11表2-3正交试验Ly(34)结果处理 12表2-4磷酸二氢钾对产生林可霉素的影响结果 13表3-5前体酪氨酸对产生林可霉素的影响测量结果 14图表清单图1林可霉素结构式 3图1-1葡萄糖标准曲线 7图1-2平板效价图 8图2-1菌种在不同时期的菌体状态 10图2-2不同时间正交试验结果线形图 13图2-3磷酸二氢钾对产生林可霉素的影响结果柱形图 14图2-4前体酪氨酸对产生林可霉索的影响测量结果柱形图 16引言林肯链霉菌是放线菌属中链霉菌的一种，基丝无横隔，直径大约为0. 5-0. 8gmo可 产生一种林可胺类碱性物质一-林可霉素林可霉素一种林可胺类抗生素，对多数革兰氏阳性菌有较强抑菌活性，特别是对链 球菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌及厌氧菌的抗菌作用尤为明显在人体内分布广泛， 对于呼吸系统、骨髓炎及软组织感染等疾病有很好的治疗作用，尤其适用于对青霉素过 敏的病人⑴因此林可霉索具有很重要的药用价值，同吋在工业上也具有很重要的经济 价值林可霉素含A、B两组分，其主要成分为A组分，分子式为GgHsNAS,相对分子量 为406. 56,其结构见图1。

两组分在结构丄的区别为：A组分在4位上为正内基，而B 组分为乙基，B组分无抑菌作用OHA组分（林可亲》 R=CiHrB 组分 I 林可 WJKS〉 R = C^HsBH1 林可素结樹式在当今科技发达的时代，生物产品已经成为时代的主流林可霉素作为临床应用的 主要抗生素也是人们研究的热点FI前国外对林可霉素的研究主要集中在基因调控、代 谢及作用机理方面的研究国内大部分研究的是其工业应用方面，如菌种的诱变筛选 等但是一•个好的菌株出现，不仅仅是诱变筛选的结果，只有选择最住的生长环境和 代谢合成产物的最佳环境才能最大限度的发挥出菌株的潜在能力，实现研究的最高价 值正因为培养基在生产中的重要地位，培养基的优化也成为H前研究的重点，如童婷 [8\周哓荣⑼所做的关于培养基成份的优化等方而的研究碳源是发酵过程中合成菌体及抗生素的能量和碳素来源；氮源是用来构成菌体的蛋 白质、核酸等含氮物质以及抗牛索等含氮代谢产物的；磷是核酸和蛋白质的必要组成成 分，也是重要的能量传递者-一ATP的主要成分；酪氨酸是林可霉索合成的前提物质，培 养基成分中酪氨酸的含量对产量有一定的影响鉴于碳氮源、磷酸盐和前体物质的重要性本实验选择了以淀粉、葡萄糖（碳源）, 玉米浆、豆饼粉（氮源），磷酸二氢钾（磷酸盐）和前体酪氨酸等因素为研究对象，以 确定林可霉索发酵的最佳培养基配比。

第一章材料与方法1・1试验菌林肯链霉菌SL-98、藤黄八叠球菌（由安徽工程科技学院生物技术实验室提供）1.2实验主要仪器表1-1主要仪器仪器名称产家恒温恒湿振荡培养箱SPH-2102C上海世平实验设备有限公司SPX-250BS- II生化培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司电了天平FC104双圈牌上海精科恒温水浴锅HH-2国华电器有限公司立式电热压力蒸汽火菌器LDZX-50KBS上海申安医疗器械厂PIISJ-3F实验室pH计 雷磁牌上海精密科学仪器有限公司离心机中外合资深圳天南海北有限公司显微镜XSP-2CA上海滴定装置天律市东丽教学仪器厂培养1111上海五一玻璃仪器厂牛律杯上海市药品研究所200ul 移液枪 X57404E法国制造游标卡尺LINKS BRAND哈尔滨量具刀具厂马头牌JYT-5架盘药•物天平上海医用激光仪器厂隔水式电热恒温培养箱上海新苗医疗器械制造有限公司电热恒温鼓风干燥箱上海新苗医疗器械制造有限公司SW-CJ-2FD双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司此外还需要的仪器有烧杯、电炉、三角烧瓶、接种铲、陶瓦盖等1.3试验药品表1-2主要试剂试验药品产家硫酸鞍上海试剂一厂综合经营公司经销磷酸二氢钾国药集团化学试剂有限公词淀粉菱湖精细化工厂葡萄糖AR国线集团化学试剂有限公司L-酪氨酸惠兴生化试剂有限公司酚酥 C2oHmOi天律市化学试剂一厂蛋白腺BR国药集团化学试剂有限公司蔗糖国药集团化学试剂有限公司其他药品还有豆粉、碳酸钙、玉米浆、氯化钠、硝酸钠、KNO3、FeSOMHQ、MgSO4琼脂（宝石牌）等。

1.4培养基配方1.4.1斜面培养基的配制可溶性淀粉2. 0%（单独糊化）、豆饼粉0. 5%、琼脂1. 7-2. 1%, NaClO. 05%、KN030. 01%、 K2HPO4 0.05%、FeS04-7H20 0. 001%（现配现用）、MgSO’ 0. 05%（最后加入）、蒸馅水配制, pH 消前自然，消后 6. 5-6. 7o 培养基长度 1/2、C 总 1. 7-2. lg/100mL, C 还0. 6g/100mL, NH2~N 10~16mg/l00mLo1.4.2种子培养基的配制淀粉2. 0%、葡萄糖1. 5%、豆饼粉2.0%、硫酸钱0. 15%、玉米浆3. 0%、碳酸钙0. 4%, 消前pH7. 0-7. 2,消后pH7. 2,种子培养基装量10%1.4.3发酵培养基的配制淀粉2. 0%、葡萄糖9. 0%、豆饼粉2. 0%、玉米浆0. 3%、氯化钠0. 4%、硝酸钠0. 8%、 硫酸讓0.7%、碳酸钙0.8%、磷酸二氢钾0. 025%,消前pH7. 0-7.4,消后pH6・8-7. 2 （调 节后再加入碳酸钙），摇瓶培养基装量10%1・4・4肉汤琼脂培养基（测量效价培养基）的配制蛋白腺6g/L、酵母膏6g/L、牛肉膏1. 5g/L、葡萄糖lg/L、琼脂15g/L, pH7. 8-8. 0。

以JL培养基均在121C下灭菌20mino1・5试验方法]5]斜而培养方法将生长良好、他子丰满，没有受到杂菌污染的单菌落用接种针将其挑入斜面，均匀 的涂满斜面，把斜面放入恒温培养箱在温度29. 5-29. 8C.湿度35%条件下培养6. 5-7d斜面指标：密的背后黄色，稀的背后褐色至棕褐色1. 5. 2种子培养方法种子培养基按1.4.2配制后，装量：25mL/250mL, 50mL/500mLo接入林肯链霉菌, 接种量15-25个菌落/瓶，培养条件：温度30C,湿度45%,转速180r/min，培养54h为还原糖含量为0. 5-0. 6g/100mL、氨基氮为60-80mg/mL.菌浓为22-28%. pH为 7.1-7. 4时菌种可以从种子培养基中接种到发酵培养基中1. 5. 3发酵培养方法按1.4.3配制好发酵培养基后，装量：25mL/250mL, 50mL/500mLo待种子生长到一 定阶段（达到接种指标后），接入发酵培养基中（接种量6%）培养培养条件：温度30C\ 湿度45%、转速220r/min,培养9d1.6分析测定方法1.6.1氨基氮的测定切1.6. 1. 1 原理利用甲醛法测定，测定结果是氨基氮和氨盐氮含量的总和。

一分子氨盐与甲醛作用, 生成六次甲基四胺及一分子无机酸，后者以碱滴定，从而标定出氨氮含量，氨基氮氨基 酸的氨基与甲醛结合，使氨基酸碱性消失，再用标准液来滴定竣基，标出氨基氮4NHJ+6HCH0 二 也）収用+6也0+3川NaOH + H=Na+H2O1. 6. 1. 2试剂与器材1NHC1取在盛有917mL的蒸倔水的试剂瓶中，缓缓加入83mL浓盐酸，待冷却后定溶摇匀 0. O5NNaOH称取0.2g加入lOOmL容量瓶中,定容,摇匀,后标定为0. 03761mol/Lo 中性甲醛溶液在50mL 36%-37%（质量分数）甲醛溶液中加入ImL 0.5%酚駄乙醇水溶液，用 0. O5NNaOH滴定到微红，贮于密闭的玻璃瓶中，此试剂在使用前配制酚駄批示剂（0. 05%酚駄乙醇水溶液）称取0・5g酚駄置于100mL小烧杯中,加入lOOmL无水乙醇充分搅拌使溶解,将溶 液转至100mL试剂瓶中待用，pH变色范围为8. 0-10. 0（无色变红）0. 1%的甲基红批示剂的配制取甲基红0. lg加入0. 05mL/LNa0H溶液7. 4mL使之溶解，再加水稀释至200mL得到 的变色范围pH为4. 2-6. 3 （红变黄）o1.6. 1.3操作步骤吸取待测液（发酵液上清液）2. 5mL于250niL三角烧杯中，加水约50mL,加甲基红批 示剂2-3滴,加1NHC1 1-2滴,使成红色,放置3min,然后再以0. 05N NaOH调至橙黄 色，加入中性甲醛10mL,放置5-10min,加酚駄指示剂ImL,用0. 05NNaOH滴定至粉红 色为终点。

计算公式：氨基氮含量（N, mg/100mL） =M^V,^100/V2=0. 03761* V】*14*100/2・ 5二21.056/ （式 IT）1.6.2还原糖的测定"1.6. 2. 1 原理在发酵过程分析淀粉和葡萄糖，通过酸水解作用，淀粉可以转化为葡萄糖，单糖分 子中的醛基具有还原性，在碱性溶液中能将二价铜离子还原为亚铜离子，剩余的铜在酸 性溶液中与碘化钾反应，析出游离碘用标准硫代硫酸钠溶液滴定，从空白与样甜所消耗 的NaS从标准溶液得体积的差值，推算糖的含量（以葡萄糖计），测定小用到的C中，KI, 事先配制碱性溶液，称为斐林试剂•斐林试剂为一碱性Cf试剂，内含Cu2\KI, NaOH及 酒石酸钾钠，酒石酸钾钠的作用是与C中生成络合物，避免C中在碱性溶液中生成Cu （OH）2 沉淀1.6. 2. 2试剂与器材标准葡萄糖溶液准确称取0. 6000g （0. 0005）分析纯葡萄糖于100mL容量瓶中，加水溶解，定容, 摇匀斐林试剂A液：称取120g无水硫酸铜，用蒸锚水溶解并稀释至2000汕B液：称取250g NaOH和375g酒石酸钾钠，用蒸馅水溶解并稀释至2000mL （NaOH 溶解时要缓慢加入）。

C液:称取300g碘化钾，用蒸憾水溶解并稀释至lOOOmLo将A液和B液混合摇匀后，加入C液充分振荡即可斐林试剂的标定精确量取10mL的新配斐林试剂至250mL锥形瓶中,加入6. Omol/L HCL溶液6mL, 轻轻振荡均匀后，用0. lmol/L硫代硫酸钠滴定至黄色消失记录消耗的标准硫代硫酸 钠溶液的体积1.6. 2. 3操作步骤1.6. 2. 3. 1•糖标准曲线的制备精确量取糖标准溶液 0. 3mL> 0. 6mL、0. 9mL> 1. 2mL> 1・ 5mL、1. 8mL> 2. lmL> 2. 4mL、 2. 7inL、3. OmL加入150mL的三角瓶中,精确加入10mL的斐林混合液，100C沸水浴10 分钟后，取出冷却至室温，用酸式滴定管加入6. OmL的6.0mol/L的HCL,边加边轻轻震 荡，使盐酸与三角瓶内溶液充分接触，用硫代硫酸钠标准溶液滴定溶液将现乳片色吋， 加入l-2mL 0. 5%淀粉指示剂，继续滴定至蓝色刚好消失，同时以10讥斐林试剂作空白， 以葡萄糖量（g/100mL）为纵坐标，空白滴定数减去样品滴定数为横坐标，绘出标准曲 线图Xa^SvOi图1-1葡萄糖标准"11线1.6.2.3.2还原糖的测量将发酵液离心分离，取出上清液lmL（如含糖量较高则取0. 5mL）于150mL三角烧瓶 中,加蒸憾水10mL,摇匀后准确加入斐林试剂20mL。