重组质粒的筛选.docx

重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与 非重组子以及鉴定所需的特异性重组子在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化；即使 获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选筛选的方法包括根 据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等本实验采用遗传表 型筛选中的抗生素平板筛选或a互补筛选的方法抗生素平板筛选【实验原理】 目标基因是Kan的抗性基因，而载体含Amp的抗性基因，因此在含有Amp和Kan的培养基中 生长的菌落即为阳性菌落大多数质粒载体都是用抗菌素抗性标记,包括氨苄青霉素抗性（Ampr）＞卡那霉素抗性（Kanr）、 四环素抗性（Tetr）、链霉素抗性（Strr）和氯霉素抗性（Cmlr））等i）氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）是青霉素的衍生物，通过干扰细菌细胞壁合成的末端 反应，杀死生长的细菌细菌质粒Amp r基因编码b-内酰胺酶，特异地切割氨苄青霉素的b- 内酰胺环ii） 氯霉素（chloramphenicol，Cml）通过与50S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合 成并阻止肽键的形成杀死生长的细菌。

细菌抗性原理是Cml r编码乙酰转移酶，特异地使 氯霉素乙酰化而失活iii） 卡那霉素（kanamycin，Kan）通过与70S核糖体结合，导致mRNA发生错读杀 死细菌而Kan r编码的氨基糖苷磷酸转移酶，对卡那霉素进行修饰，阻断其与核糖体结合 作用iv） 链霉素（Streptomycin， Str）通过与30S核糖体亚基结合，导致mRNA错译杀死 细菌Str r编码一种氨基糖苷磷酸转移酶对链霉素进行修饰，阻断其与核糖体30S亚基结合 作用v）四环素（Tetracycline，Tet）通过于30S核糖体亚基结合，干扰细胞蛋白质的合成并阻 止肽键的形成杀死生长的细菌Tet r编码特异性蛋白质，对细菌的膜结构进行修饰，组止 四环素通过细胞膜进入细菌细胞内抗生素抗性筛选原理是：不带有抗菌素抗性基因的受体菌不能在含有抗菌素的培养基（选 择培养基）中生长当带有抗菌素抗性基因的载体进入受体菌后，受体菌才能生长操作步骤】 1 •制备含有Amp和Kan的LB琼脂培养板2•将100p l转化菌液用无菌涂布器均匀涂布于含有Amp和Kan培养板上,7°C培养12-16h3•在含有Amp和Kan培养板上能生长的菌落即为阳性重组质粒。

并将其接种于含Kan的LB 液体培养基2ml中培养8T6h4 •小量制备质粒，限制性酶切分析进一步鉴定二、a互补筛选【实验原理】适用于含有半乳糖苷酶基因（LacZ）的载体，如pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的 调控序列和N端146个氨基酸的编码信息在这个编码区中插入了一个多克隆位点当这种 载体进入可编码0 -半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后（质粒和宿主细胞编码的片段各自 都没有酶活性），它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫a互补由 a互补而产生的Lac细菌在呈色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-0 -半乳糖苷（X-gal）和诱导剂异 丙基硫代-0 -D-半乳糖苷（IPTG）存在下形成蓝色菌落当外源DNA插入到质粒的多克隆位 点后，导致产生无a互补能力的氨基端片段因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落通 过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分 析，即可确定这些质粒的结构试剂】1. X-gal （20mg/m l）：将20mg X-gal溶于l ml二甲基甲酰胺中，-20C避光保存2. IPTG （200mg/ml）：将1g IPTG溶于4 ml去离子双蒸水中，定容至5 ml,用0. 22p m过 滤器除菌，-20C保存备用。

操作步骤】1 •制备含相应抗生素的琼脂平板2•于平板表面加X-gal 40p l和IPTG 4p l,并用无菌玻璃涂布器将试剂均匀涂布于整个 平板表面37C静置l h3. 将100 Ml转化的菌液涂布于平板表面，置37°C培养箱20 min后，倒置平板继续培养12〜 16h4•中止培养后，将平板静置4C 4h,使蓝色充分显现，平皿上显示蓝色和白色两种菌落5•挑取白色菌落置2 ml LB （含相应抗生素）液体培养基中，37C摇床培养8〜12h6 •提取质粒，以限制性酶切分析进一步鉴定。