DNA重组实验原理及步骤.docx

实验十 DNA重组 一、实验原理 外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这种重新组合的DNA叫做重组子DNA在体外的连接重组是基因工程操作的核心技术之一，其本质是一个酶促反应过程即在一定的条件下，DNA连接酶催化两个双链DNA片段的5¹端磷酸和3¹端羟基之间相互作用，形成磷酸二酯键的过程常用的DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶其中T4噬菌体DNA连接酶对底物的要求低，能更有效地连接DNA的平末端，应用更广泛T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分3步：①首先，ATP与T4噬菌体DNA连接酶通过ATP的磷酸与连接酶的赖氨酸的氨基形成酶―ATP复合物②被激活的AMP随后从赖氨酸残基转移到DNA一条链的5¹端的磷酸基团上，形成磷酸―磷酸键③DNA链3¹端的羟基被活化，取代ATP后与DNA5¹端的磷酸根形成磷酸二酯键，并释放出AMP，完成DNA之间的连接T4噬菌体DNA连接酶需要镁离子和ATP作为辅助因子，在一定的温度和pH条件下进行连接反应二、仪器及试剂：1. 仪器：台式离心机、移液器、吸头、恒温水浴锅等2. 试剂：T4 DNA连接酶、10×T4 DNA连接酶缓冲液、 载体DNA、外源DNA。

三、操作步骤1. 外源DNA片段和载体DNA的连接取1只无菌Ep管、用微量进样器按下列顺序加入各成分10×T4 DNA Ligase Buffer 2.5 ul酶切后的DNA片段 *1 约0.3 pmol酶切后的载体DNA *2 约0.03pmolT4 DNA Ligase 1ulddH2O 加至 25ul*1 DNA片段的摩尔数应控制在载体DNA摩尔数的3－10倍2 相同末端的载体与DNA片段进行连接时，应首先将载体进行去磷酸化处理，以防止其自身环化2.盖好盖子，用手指轻弹Ep管数次，并于台式离心机离心2s 以集中溶液3.将反应管放入16℃过夜反应（12～16h）4.取出约25ng的DNA连接液进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定连接结果，以未经连接的质粒DNA片段和酶切DNA片段作电泳5.用0.1×TE将连接混合物稀释至50ul，使用10～20ul转化大肠杆菌感受态细胞。

四、注意事项1. 连接产物经鉴定后应迅速做转化实验2. 根据具体情况调节酶的用量平端连接或接头连接都比黏端连接慢得多，而且酶的用量也增大3. 单价阳离子或低浓度的聚乙二醇可提高平端连接的效率4. 防止载体DNA自身环化，常用碱性磷酸酶处理线性载体，去掉载体的5¹?C磷酸以抑制DNA片段的自身环化5. 正确调整载体DNA和外源DNA之间的比例有助于获得高产量的重组产物五、相关问题1. 连接反应的影响因素除了载体、供体的浓度及其比例等因素外，影响连接反应的因素还有很多，如缓冲液组分、连接温度与时间、酶浓度、DNA浓度及片段末端的碱基序列等1）连接缓冲液的影响不同的公司提供的连接缓冲液可能有所不同，但大体上都含有以下组分：20-100mmol/L的Tris-HCl，较多用50mmol/L，pH的范围在7.4-7.8，较多用7.8，目的是提供合适酸碱度的连接体系；10mmol/L的MgCl2，作用是激活酶反应；1-20mmol/L的DTT，较多用10mmol/L，作用是维持还原性环境，稳定酶活性，25-50ug/ml的BSA，作用是增加蛋白质的浓度，防止因蛋白浓度过稀而造成酶的失活与限制酶缓冲液不同的是连接酶缓冲液还含有0.5-4mmol/L的ATP，现多用1mmol/L，是酶反应所必需的。

2）pH的影响一般将缓冲液的pH调节到7.4-7.8，较多用7.8有实验表明，若把pH为7.5-8.0时的酶活力定为100%，那么体系偏碱（pH为8.3）时仅为全部活力的65%；当体系偏酸（PH为6.9）时仅为全部活力的40%3）ATP浓度的影响连接缓冲液中ATP的浓度在0.5-4mmol/L之间，较多用1mmol/L研究发现，ATP的最适浓度为0.5-1mmol/L，过浓会抑制反应例如，5mmol/L的ATP会完全抑制平末端连接，黏端的连接也有10%被抑制；还有报道，当ATP的浓度为0.1mmol/L时，去磷酸载体的自环比例最大由于ATP极易分解，所以当连接反应失败时，除了DNA与酶的问题外，还应考虑ATP的因素含有ATP的缓冲液应于-20℃保存，溶化取用后立即放回连接缓冲液体积较大时最好分小管贮存，防止反复冻融引起ATP分解与限制酶缓冲液不同的是，含ATP的连接缓冲液长期放置后往往失效，所以也可自行配制不含ATP的缓冲液（可长期保存），临用时加入新配制的ATP母液4）连接温度与时间的影响因为黏性末端的DNA双链间有氢键的作用，所以温度过高会使氢键不稳定，但连接酶的最适温度又恰为37℃。

为了解决这一矛盾，在经过综合考虑后，传统上将连接温度定为16℃，时间为4-16h现经实验发现，对于一般的黏性末端来说，20℃ 30min就足以取得相当好的连接效果，当然如果时间充裕的话，20℃ 60min能使连接反应进行得更完全一些对于平末端是不用考虑氢键问题的，可使用较高的温度，使酶活力得到更好的发挥5）酶浓度的影响根据New England Biolabs公司对T4 DNA连接酶的定义，1U的酶可在16℃ 30min内连接20ul体系中Hind Ⅲ酶切片段（黏性末端为0.12umol/L 5,末端，此时DNA质量浓度约为300ng/ul）的50%日常使用的DNA浓度比酶单位定义状态低10-20倍，连接平末端时酶用量要比连接黏端大10-100倍，厂商为了满足这一要求，又往往提供高浓度的酶（几百个单位/ul），所以进行黏末端连接时需先行稀释除了立即用于反应的部分可用酶反应缓冲液稀释外，其余都应使用厂商提供的稀释液稀释液的成分与酶保存缓冲液相同或类似，稀释液中的酶能在长时间保持活力，也便于随时取用6）DNA浓度的影响尽管有的实验手册上推荐使用0.1-1nmol/L的DNA浓度，但考虑到用质粒作为载体克隆时，最后要求得到环化的有效连接产物，所以DNA浓度不可过高，一般不会超过20nmol/L。

相比较而言，以噬菌体、cosmid质粒为载体的克隆过程最后要求线性化的连接产物，所以，DNA的浓度可以高些，至少是接近推荐的浓度此外，在用大质粒载体进行大片段克隆时，以及在双酶切片段的连接反应中，DNA浓度还应降低，甚至是DNA的总浓度低至几个nmol/L另据研究，T4 DNA连接酶对DNA末端的表观Km值为1.5nmol/L，所以，连接时DNA浓度不应低于1nmol/L即应具有2nmol/L的末端浓度2. 三种连接酶单位定义（1）Weiss单位连接酶单位最早是1968年由Weiss提出的Weiss单位，现也称PPi单位他的单位定义为：37℃ 20min内将1nmol的32P从焦磷酸根上置换到ATP分子上所需的酶量现在大多数厂商仍使用这种单位2）d（A-T）环化单位由于Weiss单位定义中测试的是T4 DNA连接酶中除连接功能外的另一种磷交换功能，并且测试温度高达30℃，与实际连接反应相比无论在哪一方面都有一定的差距，于是，1970年Modrich与Lehman提出了真正度量连接功能的d(A-T)环化单位，又称外切酶抗性检测d（A-T）环化单位的定义为：30℃ 30min 内将100nmol/L的d（A-T）（约2kb长）转化成抗外切酶的形式。

3）黏性末端单位与Weiss单位相比，d（A-T）环化单位更接近实际，但仍有一定的问题，例如，环化单位测试中用的是纯AT片段，与实际连接中4种碱基随机排列不符；再说，如果连接酶将片段连接成多聚体而末环化时，仍可能被外切酶组所切；除此之外，与实际上大多数连接反应使用的温度16℃相比，30℃仍显得偏高为了衡量实际连接条件下的酶活力，New England Biolabs公司提出了最实用的黏性末端单位，它的单位定义为：16℃ 30min内将5,末端浓度为0.12umol/Lλ-HindⅢ 酶切片段的50%连接上。