第一章 植物组织培养的基本知识及操作技术.ppt

第一章￿植物组织培养基本知识及操作技术第一节第一节 植物组织培养的一般原理植物组织培养的一般原理n n一、植物细胞全能性一、植物细胞全能性 一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发一个细胞一旦沿着某一条特定的途径分化发育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织育后，一般不会再回复到未分化状态，但在组织培养条件下，可能发生脱分化和再分化培养条件下，可能发生脱分化和再分化TotipotencyTotipotency：：：：Each cell of a Each cell of a multicellularmulticellular organism contains all of the genes needed to organism contains all of the genes needed to form the whole plantform the whole plant. .n n二、细胞全能性的实现二、细胞全能性的实现1. 1. 实现条件：实现条件：实现条件：实现条件：离体；培养条件离体；培养条件离体；培养条件离体；培养条件2. 2. 经历的过程：经历的过程：经历的过程：经历的过程：脱分化脱分化----再分化再分化----3. 3. 再分化的方式再分化的方式再分化的方式再分化的方式器官发生器官发生胚胎发生胚胎发生n离体的植物组织在组培条件下形成吴根苗、根、离体的植物组织在组培条件下形成吴根苗、根、芽等器官的过程称为器官发生。

芽等器官的过程称为器官发生发生类型发生类型发生类型发生类型发生方式发生方式发生方式发生方式直接途径直接途径间接途径间接途径先芽后根先芽后根先根后芽先根后芽根芽同时发生根芽同时发生n n植物细胞未经过性细胞的融合而通过与合子胚发生植物细胞未经过性细胞的融合而通过与合子胚发生植物细胞未经过性细胞的融合而通过与合子胚发生植物细胞未经过性细胞的融合而通过与合子胚发生类似的途径形成完整植物的过程称为胚胎发生类似的途径形成完整植物的过程称为胚胎发生类似的途径形成完整植物的过程称为胚胎发生类似的途径形成完整植物的过程称为胚胎发生外植体外植体外植体外植体→→胚状体胚状体胚状体胚状体→→再生植株再生植株再生植株再生植株外植体外植体外植体外植体→→愈伤组织愈伤组织愈伤组织愈伤组织→→胚性愈伤组织胚性愈伤组织胚性愈伤组织胚性愈伤组织→→胚状体胚状体胚状体胚状体→→再生植株再生植株再生植株再生植株比较容易实现细胞全能性的细胞：受精卵、分生比较容易实现细胞全能性的细胞：受精卵、分生组织细胞、雌雄等组织细胞、雌雄等第二节第二节 植物组织培养实验室的建立植物组织培养实验室的建立 组织培养实验室布局的总体要求：组织培养实验室布局的总体要求： 便于隔离 便于操作 便于灭菌 便于观察基本实验室辅助实验室实验室组成准备室缓冲室无菌操作室培养室细胞生物学实验室温 室生化分析实验室一、构成与配置一、构成与配置基本实验室布局平面图实验台搁架培养架培养架培养架培养架药品及仪器柜无菌台无菌台搁架拉窗冰箱搁                架水槽电炉门4.5m3.0m3.5m4.0m准备室准备室缓冲室缓冲室无菌室无菌室培养室培养室组织培养准备实验室缓冲室培养室无菌室（一）无菌室（二）n n二、主要单元功能介绍：二、主要单元功能介绍：n n1. . 准备室：准备室：n n洗涤区：洗涤区：排水良好、地板耐湿排水良好、地板耐湿n n灭菌区：灭菌区：地面、墙面防潮、耐高温；绝缘地面、墙面防潮、耐高温；绝缘n n化学实验区：化学实验区：器皿洗涤、干燥、保存；药品称量、器皿洗涤、干燥、保存；药品称量、溶解；培养基配制；材料预处理；培养材料观察溶解；培养基配制；材料预处理；培养材料观察分析等。

主要设备包括：工作台、药品柜、冰箱、分析等主要设备包括：工作台、药品柜、冰箱、烘箱、天平、蒸馏水器等烘箱、天平、蒸馏水器等n n2. 2. 无菌操作室：无菌操作室： 要求：要求：无菌；光照好；墙面尽可能光滑、易消毒；无菌；光照好；墙面尽可能光滑、易消毒；防止空气对流；具有消毒措施（甲醛熏蒸、紫外防止空气对流；具有消毒措施（甲醛熏蒸、紫外灯照射）灯照射） 设备：设备：超净工作台；接种箱超净工作台；接种箱n n3. 3. 培养室：满足植物材料的生长培养室：满足植物材料的生长 要求：要求：采光；保温；隔热；控温；控光；暗室采光；保温；隔热；控温；控光；暗室 设备：设备：培养架；控温设备培养架；控温设备n n4. 4. 细胞学实验室：培养材料的分析、照相细胞学实验室：培养材料的分析、照相 设备：设备：显微镜、解剖镜、染色设备显微镜、解剖镜、染色设备n n三、常用仪器设备三、常用仪器设备n n（一）仪器（一）仪器n n1. 1. 天平天平 精度精度1/10 1/10 药物天平：大量元素、蔗糖、琼脂药物天平：大量元素、蔗糖、琼脂 精度精度1/10000 1/10000 分析天平：维生素、激素、微量元分析天平：维生素、激素、微量元 素及附加物素及附加物 精度精度1/1000 1/1000 扭力天平：扭力天平：n n2. 2. 灭菌锅灭菌锅 普通医用灭菌锅普通医用灭菌锅 大的高压灭菌锅大的高压灭菌锅 培养基、水、各种器皿的消毒灭菌培养基、水、各种器皿的消毒灭菌n n3. 3. 烘箱（干燥箱）烘箱（干燥箱） 8080℃℃ 测定植物组织干重测定植物组织干重 80-100 80-100 ℃℃ 烘干物品烘干物品 150-160 150-160 ℃℃ 干热灭菌干热灭菌n n4. 4. 冰箱冰箱 试剂和母液的贮藏；细胞及其他材料的冷藏保试剂和母液的贮藏；细胞及其他材料的冷藏保存；植物材料的处理等。

存；植物材料的处理等n n5. 5. 酸度计酸度计 培养基及酶制剂的培养基及酶制剂的pHpH值调整值调整n n6. 6. 超净工作台超净工作台n n7.蒸馏水器/纯水器n n8. 8. 细胞培养设备细胞培养设备n n9. 9. 培养架培养架10、细胞学鉴定设备光学研究显微镜、实体显微镜、倒置显微镜光学显微镜n n（二）必要器皿n n1. 玻璃器皿 培养器皿：培养皿、试管、三角瓶培养器皿：培养皿、试管、三角瓶 盛装器皿：烧杯、试剂瓶盛装器皿：烧杯、试剂瓶 计量器皿：量筒、容量瓶、吸管计量器皿：量筒、容量瓶、吸管 其它：漏斗、玻棒、滴瓶其它：漏斗、玻棒、滴瓶培养皿三角瓶培养瓶n n2. 2. 金属器皿金属器皿 镊子类镊子类 剪刀类剪刀类 分离器械分离器械镊子接种针解剖刀n n（三）常备药品（三）常备药品n n1. 1. 大量元素、微量元素、维生素、氨基酸大量元素、微量元素、维生素、氨基酸n n2. 2. 糖类：蔗糖、果糖、葡萄糖糖类：蔗糖、果糖、葡萄糖n n3. 3. 凝固剂：琼脂、凝胶凝固剂：琼脂、凝胶n n4. 4. 激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素激素：生长素、细胞分裂素、赤霉素第三节第三节 植物组织培养的一般技术植物组织培养的一般技术n n一、外植体的选择和处理一、外植体的选择和处理n n二、培养基及制备二、培养基及制备n n三、无菌技术三、无菌技术n n四、培养环境四、培养环境一、外植体的选择和处理一、外植体的选择和处理n n1. 1. 外植体的类型外植体的类型外植体的类型外植体的类型 分生组织分生组织 带芽外植体带芽外植体 胚胚 雌雄配子体雌雄配子体n2. 外植体的选择和处理外植体的选择和处理 取材植株预栽培取材植株预栽培 取材植株的预处理取材植株的预处理 培养材料的贮藏培养材料的贮藏 外植体的预处理外植体的预处理 外植体的消毒、灭菌外植体的消毒、灭菌 外植体的切离和接种外植体的切离和接种二、培养基及制备二、培养基及制备n n（一）培养基的组成（一）培养基的组成（一）培养基的组成（一）培养基的组成 植物体内至少含有几十种化学元素，其中大部分元素在植物体内起到一定的生理作用：a、组成各种化合物，参与机体的建造，成为结构物质；b、构成一些特殊的生理活性物质，参与活跃的新陈代谢；c、元素之间相互协调，以维持离子浓度平衡、胶体稳 定、电荷平衡等点化学方面的作用；d、发育方面，特定的元素影响植物的形态发生和组织、 器官建成。

其它添加物其它添加物其它添加物其它添加物碳水化合物碳水化合物碳水化合物碳水化合物植物生长调节剂植物生长调节剂植物生长调节剂植物生长调节剂有机营养物有机营养物有机营养物有机营养物无机营养物无机营养物无机营养物无机营养物培养基组成培养基组成1、无机营养元素、无机营养元素(inorganic element) 1)1)1)1)大量元素：指浓度大于大量元素：指浓度大于大量元素：指浓度大于大量元素：指浓度大于0.5mmol0.5mmol0.5mmol0.5mmol／／／／L L L L的元素 [N[N[N[N、、、、P P P P、、、、K K K K、、、、MgMgMgMg、、、、S S S S和和和和CaCaCaCa等等等等] ] ] ]2)2)2)2)微量元素：指小于微量元素：指小于微量元素：指小于微量元素：指小于0.5mmol0.5mmol0.5mmol0.5mmol／／／／L L L L的元素 [Fe[Fe[Fe[Fe，，，，B B B B，，，，MnMnMnMn，，，，CuCuCuCu，，，，MoMoMoMo，，，，CoCoCoCo等等等等] ] ] ]。

2 2、有机化合物、有机化合物、有机化合物、有机化合物(organic compound)(organic compound) F最最最最常常常常用用用用的的的的碳碳碳碳源源源源是是是是蔗蔗蔗蔗糖糖糖糖，，，，葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖和和和和果果果果糖糖糖糖也也也也是是是是较较较较好好好好的的的的碳源F使用浓度在使用浓度在使用浓度在使用浓度在1%-7%1%-7%，常用，常用，常用，常用3%3%F作用：碳源；维持培养基渗透压作用：碳源；维持培养基渗透压作用：碳源；维持培养基渗透压作用：碳源；维持培养基渗透压 （（（（1 1）碳水化合物）碳水化合物）碳水化合物）碳水化合物n n在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动n n种类：种类：V VBlBl( (盐酸硫胺素盐酸硫胺素) )、、 V VB6B6( (盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇) )、、 VppVpp( (烟酸烟酸) )、、 VcVc（（抗坏血酸）、抗坏血酸）、 V VHH( (生物素生物素) )、、 V VB11B11( (叶酸叶酸) )、、 V VB12B12（（钴胺素钴胺素) )等。

等n n使用浓度：使用浓度：一般用量为一般用量为0.1—1.0mg0.1—1.0mg／／L L2 2）维生素）维生素）维生素）维生素(vitamin) (vitamin) n n作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成对组织和细胞的繁殖、分及胚状体和芽的形成对组织和细胞的繁殖、分及胚状体和芽的形成对组织和细胞的繁殖、分及胚状体和芽的形成对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用化有促进作用，对细胞壁的形成也有作用 n n又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起重要作用n n使用浓度：一般使用浓度：一般使用浓度：一般使用浓度：一般为为为为lOOmglOOmglOOmglOOmg／／／／L L L L，，，，（（（（3 3）肌醇）肌醇）肌醇）肌醇 n n作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利作用：是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。

用n n种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等n n使用浓度：为使用浓度：为1010——200mg200mg／／L L4 4）氨基酸）氨基酸）氨基酸）氨基酸 ( (alminoalmino acideacide））））3 3、有机附加物、有机附加物、有机附加物、有机附加物 （天然复合物）（天然复合物）（天然复合物）（天然复合物）10%—20%10%—20%150-200ml150-200ml／／／／L L150—200g150—200g／／／／L L0.01%-0.05%0.01%-0.05%浓度：浓度：浓度：浓度：有机附加物有机附加物有机附加物有机附加物椰乳椰乳香蕉香蕉马铃薯马铃薯酵母提取液酵母提取液4 4、植物生长调节物质、植物生长调节物质、植物生长调节物质、植物生长调节物质(hormone)(hormone) l赤霉素（赤霉素（赤霉素（赤霉素（gibberellicgibberellic acid acid））））l细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类细胞分裂素类 ( ( cytokinincytokinin ) )l生长素类生长素类生长素类生长素类( (auxinauxin) ) * *作作作作用用用用：：：：主主主主要要要要被被被被用用用用于于于于诱诱诱诱导导导导愈愈愈愈伤伤伤伤组组组组织织织织形形形形成成成成；；；；促促促促进进进进细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根。

细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根细胞脱分化；促进细胞伸长；促进生根 在在在在促促促促进进进进生生生生长长长长方方方方面面面面，，，，根根根根对对对对生生生生长长长长素素素素最最最最敏敏敏敏感感感感在在在在极极极极低低低低的的的的浓浓浓浓度度度度下下下下，，，，(10(10(10(10-5-5-5-5—10—10—10—10-8-8-8-8mgmgmgmg／／／／L)L)L)L)就就就就可可可可促促促促进进进进生长，其次是茎和芽生长，其次是茎和芽生长，其次是茎和芽生长，其次是茎和芽1 1）生长素类）生长素类）生长素类）生长素类 Ø吲哚乙酸：吲哚乙酸：吲哚乙酸：吲哚乙酸：IAAIAA（（（（indo acetic acidindo acetic acid））））Ø萘乙酸：萘乙酸：萘乙酸：萘乙酸：NAANAA（（（（naphthalene acetic acidnaphthalene acetic acid））））Ø吲哚丁酸：吲哚丁酸：吲哚丁酸：吲哚丁酸：IBAIBA（（（（indolebutyriindolebutyri acid acid））））Ø2,4-2,4-二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：二氯苯氧乙酸：2,4—D2,4—D (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) (2,4-dichlorophenoxybutyric acid) * *生长素种类：生长素种类：生长素种类：生长素种类：IAA(吲哚乙酸吲哚乙酸)NAA(萘乙酸萘乙酸)IBA(吲哚丁酸吲哚丁酸)2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸二氯苯氧乙酸)生长素作用强弱顺序：生长素作用强弱顺序：强强弱弱种类：种类：种类：种类：n n6—BA(6—6—BA(6—苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤) )n nKt (kinetin Kt (kinetin 激动素激动素激动素激动素) )n nZtZt ( (zeatinzeatin 玉米素玉米素玉米素玉米素) )（（（（2 2）细胞分裂素类）细胞分裂素类）细胞分裂素类）细胞分裂素类 细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：细胞分裂素作用：①①①①促进细胞分裂与扩大。

促进细胞分裂与扩大促进细胞分裂与扩大促进细胞分裂与扩大②②②②诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸长 ③③③③抑制根的分化抑制根的分化抑制根的分化抑制根的分化Kt ( 激动素激动素)6—BA(6—苄基腺嘌呤苄基腺嘌呤)Zt (玉米素玉米素)细胞分裂素作用强弱顺序细胞分裂素作用强弱顺序强强弱弱GAGAGAGA3 3 3 3（（（（赤霉酸）：赤霉酸）：赤霉酸）：赤霉酸）： 作作作作用用用用：：：：促促促促进进进进幼幼幼幼芽芽芽芽伸伸伸伸长长长长生生生生长长长长，，，，促促促促进进进进不不不不定定定定胚胚胚胚发发发发育育育育成成成成小植株 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当有影响：当有影响：当有影响：当生长素／赤霉素比值高生长素／赤霉素比值高生长素／赤霉素比值高生长素／赤霉素比值高时有利于木时有利于木时有利于木时有利于木质部分化，质部分化，质部分化，质部分化，比值低比值低比值低比值低时有利于韧皮部分化。

时有利于韧皮部分化时有利于韧皮部分化时有利于韧皮部分化3 3）赤霉素）赤霉素）赤霉素）赤霉素5 5 5 5、培养材料的支持物、培养材料的支持物、培养材料的支持物、培养材料的支持物 ------------琼脂琼脂琼脂琼脂(agar)(agar)(agar)(agar) n n固体培养时最好的固体培养时最好的固体培养时最好的固体培养时最好的固化剂固化剂固化剂固化剂 n n用量：用量：用量：用量：6 6 6 6————10g10g10g10g／／／／L L L Ln n琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，琼脂是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，本身并不提供任何营养琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至成为溶胶，冷却至成为溶胶，冷却至成为溶胶，冷却至40 ℃40 ℃40 ℃40 ℃即凝固为固体状凝胶即凝固为固体状凝胶。

即凝固为固体状凝胶即凝固为固体状凝胶n n琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关琼脂的凝固能力除与原料、厂家的加工方式有关外，还与外，还与外，还与外，还与高压灭菌时的温度、时间、高压灭菌时的温度、时间、高压灭菌时的温度、时间、高压灭菌时的温度、时间、pHpHpHpH值值值值等因素等因素等因素等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力 优点优点优点优点: : : :操作简便，通气问题易解决，便于观察研究。

操作简便，通气问题易解决，便于观察研究操作简便，通气问题易解决，便于观察研究操作简便，通气问题易解决，便于观察研究缺点缺点缺点缺点: : : :培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触培养物与培养基的接触( ( ( (即吸收即吸收即吸收即吸收) ) ) )面积小，各面积小，各面积小，各面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分充分利用，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，同时培养物排出的代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用对组织产生毒害作用对组织产生毒害作用对组织产生毒害作用固体培养固体培养液体培养液体培养6 6、抗生物质、抗生物质、抗生物质、抗生物质(antibiotic)(antibiotic) n n种类：种类：种类：种类：青霉素、链霉素、庆大霉素等青霉素、链霉素、庆大霉素等青霉素、链霉素、庆大霉素等青霉素、链霉素、庆大霉素等n n浓度：浓度：浓度：浓度：5—20mg/L5—20mg/L。

n n作用：作用：作用：作用：可可可可防止菌类污染防止菌类污染防止菌类污染防止菌类污染7、活性炭、活性炭(active carbon) n n目的：目的：目的：目的：是是是是利用其吸附能力，减少一些有毒物利用其吸附能力，减少一些有毒物利用其吸附能力，减少一些有毒物利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响质的影响质的影响质的影响；利于生根利于生根利于生根利于生根n n使用浓度：使用浓度：使用浓度：使用浓度：1—5g1—5g／／／／L Ln n它的颗粒大小决定着吸附能力：它的颗粒大小决定着吸附能力：它的颗粒大小决定着吸附能力：它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，粒度越小，粒度越小，粒度越小，吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸吸附能力越大；温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附附力减弱，甚至不吸附附力减弱，甚至不吸附附力减弱，甚至不吸附8 8、水（、水（water)water)作用：作用：作用：作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。

过程的介质和溶媒过程的介质和溶媒过程的介质和溶媒 注意：注意：注意：注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成分的精确性大规模生产时可用自来水基成分的精确性大规模生产时可用自来水基成分的精确性大规模生产时可用自来水基成分的精确性大规模生产时可用自来水（二）培养基的选择（二）培养基的选择n n根据培养基的特点进行选择根据培养基的特点进行选择n n参考已发表的文献资料参考已发表的文献资料n n光谱实验法光谱实验法1、MS培养基 ◆无机盐浓度高           ◆高含量的氮、钾，尤其是硝酸盐           ◆含有一定数量的铵盐           ◆营养丰富           ◆不需要添加更多的有机附加物2、White培养基                    ◆1943年由White为培养番茄根尖而设计 ◆ 1963年作了改良，提高MgSO4的浓度和增加硼元素 ◆无机盐浓度较低 ◆使用广泛 ◆在生根培养、胚胎培养中有良好的效果大量元素大量元素大量元素大量元素含量含量含量含量微量元素微量元素微量元素微量元素含含含含量量量量铁盐铁盐含量含量含量含量有机物有机物有机物有机物含含含含量量量量其他其他其他其他含量含量含量含量KNOKNO3 38080HH3 3BOBO3 31.51.5FeFe2 2(SO(SO4 4) )3 32.52.5肌醇肌醇肌醇肌醇100100蔗糖蔗糖蔗糖蔗糖3000030000Ca(NOCa(NO3 3) )2 2 4H4H2 2OO300300MnSOMnSO4 4 4H4H2 2OO7.07.0烟酸烟酸烟酸烟酸0.30.3琼琼脂脂脂脂80008000MgSOMgSO4 4 7H7H2 2OO720720ZnSOZnSO4 4 7H7H2 2OO3.03.0盐盐酸硫胺酸硫胺酸硫胺酸硫胺素素素素0.10.1 NaHNaH2 2POPO4 4 4H4H2 2OO16.516.5MoOMoO3 30.000.000101盐盐酸吡哆酸吡哆酸吡哆酸吡哆辛辛辛辛0.10.1KClKCl6565CuSOCuSO4 4 5H5H2 2OO0.000.001 1甘氨酸甘氨酸甘氨酸甘氨酸3 3NaNa2 2SO4SO4200200附表：White培养基3、B5培养基 ◆1968年由Gamborg等为培养大豆根细胞而设计           ◆含有较低的铵盐 ◆较高的硝酸盐和盐酸硫胺素组成成分组成成分   数量数量(mg/l(mg/l））组成成分组成成分   数量数量(mg/l) (mg/l) KNOKNO3 3   2500 2500 FeSOFeSO4 4·7H·7H2 2OO27.8 27.8 CaClCaCl2 2·2H2O ·2H2O 150 150 CuSOCuSO4 4·5H·5H2 2O O 0.025 0.025 MgSOMgSO4 4·7H2O ·7H2O 250 250 蔗糖蔗糖40 40 (NH(NH4 4) )2 2SO4 SO4 134 134 pH pH 5.55.5KI KI 0.75 0.75 肌醇肌醇100 100 H H3 3BOBO4 4 3.0 3.0 烟酸烟酸   1.0 1.0 MnSOMnSO4 4·4H·4H2 2O O 10 10 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇   1.0 1.0 ZnSOZnSO4 4·7H·7H2 2O O 2.0 2.0 激动素激动素   0.1 0.1 NaNa2 2MoOMoO4 4·2H·2H2 2OO0.25 0.25 2,42,4－－D D 0.10.1－－1.0 1.0 CoClCoCl2 2·6H·6H2 2OO0.025 0.025 盐酸硫铵盐酸硫铵   10 10 NaNa2 2-EDTA-EDTA37.3 37.3    B5培养基的组成和配方4、N6培养基          ◆1974年朱至清等为水稻等禾谷类作物花药培养设计 ◆ KNO3和(NH4)(NH4)2 2SOSO4 4含量高，不含钼组成成分组成成分   数量数量(mg/l) (mg/l) 组成成分组成成分(mg/l) (mg/l) KNOKNO3 3   2.3 2.3 NaNa2 2－－EDTA EDTA 37.3 37.3 CaClCaCl2 2·2H·2H2 2O O 166 166 FeSOFeSO4 4·7H·7H2 2O O 27.8 27.8 MgSOMgSO4 4·7H·7H2 2O O 185185蔗糖蔗糖   50 50 KHKH2 2POPO4 4   400 400 pH pH 5.8 5.8 (NH(NH4 4) )2 2SOSO4 4   463 463 烟酸烟酸   0.5 0.5 KI KI 0.8 0.8 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇   0.5 0.5 H H3 3BOBO3 3 1.6 1.6 甘氨酸甘氨酸   2.0 2.0 MnSOMnSO4 4·4H·4H2 2O O 4.4 4.4 盐酸硫铵盐酸硫铵   1.0 1.0 ZnSOZnSO4 4·7H·7H2 2O O 1.51.5N6培养基组成及配方（三）母液的配制（三）母液的配制（三）母液的配制（三）母液的配制n n1. 1. 特点：特点： 便于微量元素的称量便于微量元素的称量 减少多次称量造成的误差减少多次称量造成的误差 保证每一材料的培养基都有相同的成分保证每一材料的培养基都有相同的成分 减少工作量减少工作量n n2. 2. 种类：种类： 大量元素大量元素 微量元素微量元素 铁盐铁盐 有机物质有机物质 激素激素母液名称母液名称 药品品 名称名称 原配方量原配方量 (mg)/ L大量元素母大量元素母液液  NH4NO31650KNO31900CaCl·2H2O440MgSO4 ·7H2O370KH2PO4170微量元素母微量元素母液液 MnSO4·H2O22.3ZnSO4·7H2O8.6CoCl·6H2O0.025CuSO4·5H2O0.02H3BO36.2Na2MO4·2H2O0.25KI0.83铁盐母液母液 FeSO4·7H2O28.7Na2-EDTA37.3有机物母液有机物母液 烟酸烟酸(Vpp)0.5盐酸吡哆醇酸吡哆醇 0.5盐酸硫胺素酸硫胺素 0.1肌醇肌醇 100甘氨酸甘氨酸 2n n3. 3. 注意事项注意事项 （（1 1）激素的溶解：）激素的溶解： 细胞分裂素细胞分裂素——0.1M ——0.1M HClHCl助溶助溶 生长素生长素——0.1M ——0.1M NaOHNaOH 或或95%95%酒精酒精助溶助溶 赤霉素赤霉素————热水或热水或95%95%酒精酒精 （（2 2）大量元素混合的顺序：）大量元素混合的顺序： KHKH2 2POPO4 4→KNO3 3、NH4 4NO3 3 →MgSO4 4 、CaCl2 2 （（3 3）标签）标签: : 培养基类型、扩大倍数、配制量、日期培养基类型、扩大倍数、配制量、日期 （（4 4）贮存：）贮存：4 4℃℃冰箱保存冰箱保存（四）培养基配制（四）培养基配制（四）培养基配制（四）培养基配制n n配制方法：配制方法：配制方法：配制方法：n n1 1、、、、将母液按顺序摆放将母液按顺序摆放将母液按顺序摆放将母液按顺序摆放n n2 2、取适量的蒸馏水、取适量的蒸馏水、取适量的蒸馏水、取适量的蒸馏水( (所需培养基量的所需培养基量的所需培养基量的所需培养基量的2/3)2/3)入容器入容器入容器入容器n n3 3、按需要量依次取母液及生长调节物质、按需要量依次取母液及生长调节物质、按需要量依次取母液及生长调节物质、按需要量依次取母液及生长调节物质n n4 4、加入蔗糖、加入蔗糖、加入蔗糖、加入蔗糖(30g/L)(30g/L)溶解溶解溶解溶解n n5 5、加琼脂、加琼脂、加琼脂、加琼脂(6-10g/L)(6-10g/L)，，，，煮沸，煮沸，煮沸，煮沸，2-3min2-3minn n5 5、、、、定容定容定容定容n n6 6、调、调、调、调PHPH值值值值(pH=5.8)(pH=5.8)n n7 7、、、、分装培养瓶，封口分装培养瓶，封口分装培养瓶，封口分装培养瓶，封口n n8 8、高压灭菌、高压灭菌、高压灭菌、高压灭菌三、无菌技术三、无菌技术消毒消毒消毒消毒: :是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，是指杀死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再发生危害作用。

使之不再发生危害作用使之不再发生危害作用使之不再发生危害作用灭菌灭菌灭菌灭菌: :是指用物理或化学的方法，杀死物体表是指用物理或化学的方法，杀死物体表是指用物理或化学的方法，杀死物体表是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有面和孔隙内的一切微生物或生物体，即把所有生命的物质全部杀死生命的物质全部杀死生命的物质全部杀死生命的物质全部杀死。