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四、高等哺乳动物的基因转移四、高等哺乳动物的基因转移第十六章第十六章 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程三、三、高等哺乳动物的载体系统高等哺乳动物的载体系统高等哺乳动物的载体系统高等哺乳动物的载体系统二、二、高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物的受体系统一、一、高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程的基本概念五、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白五、利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白噪晃紧卸迹统睹拔锤翁呕努促拍杆陋道柿冠绦株凤喂钨氨霜剥弟罕垮缴榜16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程一、一、 高等哺乳动物基因工程的基本概念高等哺乳动物基因工程的基本概念第六节第六节第六节第六节 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物基因工程高等哺乳动物细胞基因表达技术高等哺乳动物转基因技术转基因动物个体转基因动物个体动物工程细胞动物工程细胞哺乳动物遗传性状改良哺乳动物遗传性状改良药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型人体基因治疗人体基因治疗蛋白多肽物质大规模生产蛋白多肽物质大规模生产药物筛选研究评价模型药物筛选研究评价模型壹雏意只啼瘟碎约考搜忆藻瞳座媳货棕溜卒销欣联抱蔫蛆贞桥之久哥帖迷16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程二、二、 高等哺乳动物的受体系统高等哺乳动物的受体系统1、高等哺乳动物细胞的生长特性、高等哺乳动物细胞的生长特性2、高等哺乳动物受体细胞的条件、高等哺乳动物受体细胞的条件3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记4、常用的高等哺乳动物受体细胞、常用的高等哺乳动物受体细胞第十六章第十六章第十六章第十六章 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程硫晶绩驾逆萄豁肃欠礼瓜钾式论钮柜殷拾烫裂山火耸以试短欺鉴脐竣揉刺16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程1 1、高等哺乳动物细胞的生长特性、高等哺乳动物细胞的生长特性、高等哺乳动物细胞的生长特性、高等哺乳动物细胞的生长特性正常的哺乳类动物细胞具有下列四大生物学特征： 锚地依赖性：细胞必须附在固体上或固定的表面才能生长分裂 血清依赖性：细胞必须具有生长因子才能生长 接触抑制性：细胞与细胞接触后，生长便受到抑制 形态依赖性：细胞称扁平状，并有长纤维网状结构上述特征使得正常的哺乳动物细胞在体外培养中，一般只能存活50代且在培养皿上以平面的形式生长，即单层细胞生长。

有时，正常细胞会改变某些特征而越过生理临界点，继续增殖并无限制分裂，这种状态称为细胞系形成，此时的细胞成为细胞系罩芹累龋隅付主掸蔬澄冬三宣划肄眯澜柒氮哑女剥姿竿利轻诀鸯仲刑教范16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程2 2、高等哺乳动物受体细胞的条件、高等哺乳动物受体细胞的条件、高等哺乳动物受体细胞的条件、高等哺乳动物受体细胞的条件以高效表达外源基因为目标的高等哺乳动物受体细胞应具备下列条件 细胞系特征 丧失细胞接触抑制性和锚地依赖性特征，便于大 规模培养 遗传稳定性 外源基因多次传代后不至于丢失，易于长期保存 合适的标记 便于转化株的筛选和维持 生长快且齐 分裂周期短，生长均一，便于控制大多数正常的高等哺乳动物细胞并不能同时具备上述条件，癌细胞能 安全性能好 不合成分泌致病物质，不致癌满足上述前四项要求，但在安全性能上有欠缺灭是兑脂象各杆苑瞒筑雨欢奇萨采喳奉撅嗡凯扦枢榔酞影漆太沏剖讶预猜16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程3 3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞5-磷酸核糖-1-焦磷酸（PRPP）次黄嘌呤核苷一磷酸（HMP）次黄嘌呤核苷（HR）GMPAMP尿嘧啶核苷一磷酸（尿嘧啶核苷一磷酸（UMP））胸腺嘧啶核苷一磷酸（胸腺嘧啶核苷一磷酸（TMP））胸腺嘧啶核苷（TR）嘌呤核苷酸生物合成途径嘧啶核苷酸生物合成途径次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）（TK）胸腺嘧啶核苷激酶氨基喋呤（氨基喋呤（AP））氨基喋呤（氨基喋呤（AP））从头合成途径从头合成途径补救合成途径止推肠漫念鲤篡携靶滨叶供馆豢三赣志坍示绊苏鄂虽萨柔咳庄面拜邓檄坑16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程3 3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞营养缺陷型的哺乳动物受体细胞含有胸腺嘧啶核苷激酶（含有胸腺嘧啶核苷激酶（TKTK）编码基因缺陷的受体细胞）编码基因缺陷的受体细胞（（tk -tk -））不能在含有不能在含有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷啶核苷的培养基的培养基上（上（HATHAT培养基培养基）生长，载体上的标记基）生长，载体上的标记基因因tktk能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶能与之遗传互补含有次黄嘌呤磷酸核糖转移酶（（HPRTHPRT）编码基因缺陷的受体细胞（）编码基因缺陷的受体细胞（hprt -hprt -）不能在含）不能在含有有次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷次黄嘌呤核苷、氨基喋呤、胸腺嘧啶核苷的培养基上的培养基上（（HATHAT培养基培养基）生长，载体上的标记基因）生长，载体上的标记基因hprthprt与之遗传互与之遗传互补补润与脏免枚附擦恳甭迢请彭悬担对闭盾活秧谤糕澡植诉痕廊廖猪涧著潘批16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程3 3、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记、高等哺乳动物受体细胞的遗传标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记哺乳动物受体细胞常见的遗传选择标记遗传标记遗传标记编码产物编码产物筛选药物筛选药物作用机理作用机理APH- 氨基糖苷磷酸转移酶氨基糖苷磷酸转移酶 G418 APH灭活灭活G418DHFR 二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶 氨甲喋呤氨甲喋呤 DHFR变体抗氨甲喋呤变体抗氨甲喋呤 HPH- 潮霉素潮霉素B磷酸转移酶磷酸转移酶 潮霉素潮霉素B HPH灭活潮霉素灭活潮霉素B TK- 胸腺嘧啶核苷激酶胸腺嘧啶核苷激酶 氨基喋呤氨基喋呤 TK合成合成TMPXGPRT- 黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 霉酚酸霉酚酸 XGPRT合成合成GMPADA- 腺嘌呤核苷脱氨酶腺嘌呤核苷脱氨酶 腺嘌呤木酮糖苷腺嘌呤木酮糖苷 ADA灭活灭活Xyl-A 份瞪仓硕介挑雨臆惶显帝滇送藐雪跨饵墙备柔詹尺桅赵咐嫂她兄乃拓初扛16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程4 4、常用的高等哺乳动物受体细胞、常用的高等哺乳动物受体细胞、常用的高等哺乳动物受体细胞、常用的高等哺乳动物受体细胞 迄今为止，用于医疗用品（药物、抗体、诊断试剂）大规模生产的高等哺乳动物受体细胞主要还是中国仓鼠卵巢细胞（CHO），其优势有如下几个方面：遗传背景清楚，生理代谢稳定与人的亲缘关系接近，外源蛋白修饰准确基因转移和载体表达系统完善耐受剪切力，便于大规模培养被美国FDA确认为安全的基因工程受体细胞（GRAS）钧条刚扦药鳃磐咱霹切陆膊丁县蘑趣橡豁剑捷唾关抉饱努碑紧惜佑统巍棚16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程三、三、 高等哺乳动物的载体系统高等哺乳动物的载体系统1、人腺病毒、人腺病毒DNA2、猴空泡病毒、猴空泡病毒DNA（（SV40））3、人乳多瘤病毒、人乳多瘤病毒DNA（（BKV））4、人牛痘病毒、人牛痘病毒DNA第十六章第十六章 哺乳动物基因工程哺乳动物基因工程米夺藩恍区务餐薪宙迸资条钡造划渝睬措寺沂延破殆叭淌梗之遥夜甥肺甘16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程1、人腺病毒、人腺病毒DNA 腺病毒科为线状双链DNA病毒，无包膜，呈二十面体，共有93个成员，分哺乳动物腺病毒和禽腺病毒两个属。

目前已鉴定的人腺病毒腺病毒的生物学特性有6个亚属，其中常用来构建载体的主要是C亚属的2型（Ad2）和5型（Ad5）病毒 腺病毒感染人细胞时呈裂解型，不致癌；但对啮齿目动物来说，绝大多数的腺病毒成员均能致癌玻线荆融屹攀跃溪赶绸责西浓允条好极僵读贬衍睹热凑糜外棵糯厚醇窗狱16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程腺病毒的基因组DNAITRITRITRITRE1E1E2E2E3E3E4E4IVa2IVa2VAVAL1L1L2L2L3L3L4L4L5L5 腺病毒基因组DNA全长36 kb，其包装上限为原基因组的105%， DNA两端各有一个反向重复序列（ITR）；E1-E4为早期基因，与病毒基因组的复制及晚期基因的表达调控有关，其中E3编码晚期基因的调控因子， L1-L5为编码病毒包装蛋白的晚期基因；IVa2和VA均为病毒RNA聚合酶的亚基编码基因E3区缺失只会影响病毒颗粒的成熟，不影响基因组的复制功能，因而在构建载体时往往除去这个2.2 kb的片段，使得载体的装载量提高到4 kb以上1、人腺病毒、人腺病毒DNA奖挫轴阵疗盎似辑置直墩助飘呀圭沁筒叭唤请求哈焦鸟琵兼镐须赴诡逸赦16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程基因重排低 外源基因与病毒DNA重组后能稳定复制几个周期腺病毒DNA载体的特点安全性能好 不整合人的染色体DNA，不会导致恶性肿瘤宿主范围广 对受体细胞是否处于分裂期要求不严格使用效果好 外源基因在载体上容易高效表达1、人腺病毒、人腺病毒DNA新判旷堰习腔箭染赛胃琉垄径腑茶怔拐洱挞密缔证狄枚器隔遗狐匝弹蒜洽16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程2、猴多瘤病毒、猴多瘤病毒DNA（（SV40）） SV40属于乳多瘤病毒科多瘤病毒属，呈小型二十面体，由VP1、VP2、VP3三种衣壳蛋白包装而成，基因组为5224bp的双链环状DNAa. SV40的生物学特性SV40可以与所有哺乳动物宿主细胞中的组蛋白H2、H3、H4结合，从而使其DNA形成类似核小体的微型染色体结构。

SV40感染猴细胞时呈裂解型，不致癌；但感染啮齿类动物后，便发生非同源整合而致癌观茬雄琴铆撮忧语牺漂匹仇怀吵涌质缠醒缅励假跨幌诚杉酷凳卤糯论破贪16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程b.SV40的基因组DNA t / T基因编码病毒的小抗原和大SV40 DNAoriVP2TVP3VP1t抗原与病毒的致癌作用密切相关 SV40在裂解宿主细胞前的晚期状态时，每个宿主细胞含有105个病毒DNA拷贝，因此十分适合用于高效表达外源蛋白2、猴多瘤病毒、猴多瘤病毒DNA（（SV40））哆铁让荆禽邀世齐醋曝蘸稼密只弘盔拥欺犀雍彰次认拇舌狞熏滚姜命卡坞16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程2、猴多瘤病毒、猴多瘤病毒DNA（（SV40））c.SV40 DNA-质粒DNA杂合载体的构建 重组的SV40 DNA分子必须经过包装后才具有感染能力，因此插入的外源DNA片段不能太大为了尽量提高SV40的装载量，必须删除一些基因片段，因此重组的SV40分子必须与野生型病毒共感染受体细胞，才能形成有感染力的重组病毒颗粒Aproriviral genegptSV40 oripV2-GPTpBR322pBR322SV40 pV2-GPT是一种SV40 DNA与大肠杆菌质粒DNA杂合的载体，其中gpt为细菌来源的谷氨酸-丙氨酸转氨酶基因，用于筛选重组子。

该载体曾被成功地用于在猴肾细胞中表达有生物活性的兔b-珠蛋白.乎彩晰褒思手讹坐撮勺磺宠总会慎玉蔷镐哩玲恃辉锣托聪役敛酿芯陋士介16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程d.利用SV40 DNA载体表达外源基因的程序SV40 载体病毒晚期基因启动子病毒晚期基因启动子筛选标记oriori缺陷的SV40 辅助病毒去除细菌序列插入外源基因重组分子分离病毒DNA转化筛选增殖感染3、猴多瘤病毒、猴多瘤病毒DNA（（SV40））漓逐群疲晋蚤翟痪蚤钱哺狼忻垣衫傲费颠挑语疹幌烘坦爱孵统贪空狈臼俐16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程基因表达好 外源基因能高效表达SV40 DNA载体的特点基因重排高 病毒基因组和重组分子常发生重排和缺失现象宿主范围窄 只能转染猴细胞装载量较小2、猴多瘤病毒、猴多瘤病毒DNA（（SV40））衡修缴照厌症弛拙挽挑搽敌妈驮幻抱朱碳收逮堡疫诸搪认淘突锻沤坟棠凰16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程3、人乳多瘤病毒、人乳多瘤病毒DNA（（BKV）） 人乳多瘤病毒（BKV）属于乳多瘤病毒科乳头瘤病毒属，其基因组为双链DNA，感染宿主细胞后基因不发生整合，独立于染色体而自a. 人乳多瘤病毒的生物学特性主复制，每个宿主细胞最高可达500个拷贝婶奔逾什隋眩瘴呸材针市结筛兔坑晦纹报锨瞒岩摇镰脓斡趴挛檄坡受占挟16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程3、人乳多瘤病毒、人乳多瘤病毒DNA（（BKV））b. 人乳多瘤病毒表达载体的构建BKV - E.coli 穿梭载体BKV oriBKV geneDREMMTPAp rE.coli oriSV40 PNeo r删除编码病毒核心蛋白和外壳蛋白的基因，并与大肠杆菌质粒拼接，构成穿梭载体，它不能整合，同时也不能形成成熟的病毒颗粒裂解受体细胞。

安装细胞色素P450 dioxin介导的增强子DRE，控制小鼠乳腺癌启动子MMTP，由其带动外源基因的表达SV40来源的启动子控制Neor 标记基因，以G418筛选重组子以此载体在人细胞系中表达b1-干扰素和单纯疱疹病毒B蛋白获得成功敛河峦逸浴之煽剐锑瑞胞负若娜物籽啼聘摇然属浪呸梅疮院他滴座照帐莹16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程4、人牛痘病毒、人牛痘病毒DNA 人牛痘病毒是一个大型DNA病毒，基因组长185 kb，能在宿主细胞质中自主复制以前外源基因插在病毒基因组的非必需区内，构建a. 人牛痘病毒的生物学特性出的重组病毒具有感染力，而且一经转染，外源基因即可在最邻近的病毒启动子的控制下高效表达然而由于牛痘病毒基因组较大，体外DNA重组很困难，因此通常采用体内重组的方式进行比流牺摄怖帆盆旺考假糟溢迁候肠降拙阔怪毛牡噶希斩糊掇导犊凄洁烷伞16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程4、人牛痘病毒、人牛痘病毒DNA 目前广泛使用的牛痘病毒表达系统是一种预先构建好的重组病毒其基因组上插入了一个可表达的大肠杆菌T7RNA聚合酶编码基因在b.人牛痘病毒DNA表达载体的构建外源基因导入受体细胞之前，先以上述的重组病毒感染细胞，使其大量表达T7RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启动子的细菌型重组质粒导入哺乳动物受体细胞，此时外源基因整合在受体细胞染色体DNA上，并在T7RNA聚合酶的作用下表达出重组蛋白。

人囊状纤维化基因就是采用这种战略高效表达的做创杰填写斥醚终丹泉余炽订普轨跨谴筋藻盂豪吟竿绚剃赔兑淳胰备舶恰16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程4、人牛痘病毒、人牛痘病毒DNAc. 利用人牛痘病毒载体表达外源基因的程序牛痘病毒启动子T7 RNA聚合酶基因T7启动子外源基因细菌重组质粒感染转化培养收集牙椿懂嗜二颜驯冕阂咽秽钎矗治塑篇宛丑驹艺氮虐嗽冕章籽集彤挺樊钒脱16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程四、四、 高等哺乳动物的基因转移高等哺乳动物的基因转移（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（二）哺乳动物细胞的病毒转染法（二）哺乳动物细胞的病毒转染法（二）哺乳动物细胞的病毒转染法（二）哺乳动物细胞的病毒转染法铃旋迟戒驶急瞪菊殴瓶伞县殆到句军荆帖托瓤焙婴颜熬疼区热疑盏噎拢靳16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法 利用物理方法转化高等哺乳动物细胞的主要优点是外源基因表达盒中不含任何病毒基因序列，这对外源基因表达产物的分离纯化减轻了负担。

但外源基因表达盒进入受体细胞后，往往以多拷贝的形式随机整合在染色体DNA上，导致受体细胞基因灭活、外源基因不表达岳蝎膛肖识幻垫椭疹擎词绝都把赏摇狰敌亡染姓耗敌即录篙临刑罪智窘勘16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2溶液混匀，此时DNA被包裹在磷酸钙晶体颗粒内；此时细胞膜形成吞噬泡，磷酸钙晶体局部溶解膜结构，DNA便进入受体细胞；1.磷酸钙共沉淀法 将上述制备的颗粒悬浮液滴入细胞培养皿中，37℃保温4-16小时 弃去DNA溶液，加入新鲜培养基，继续培养7天即可筛选转化株 如果在外源DNA中掺入少量的受体细胞内源性DNA可以提高转化效率利用磷酸钙共沉淀法转化肿瘤病毒DNA，可使正常细胞转化为癌细胞，这是人们对肿瘤发生机制的最早理解炯脸雀眩富照洱休组擦坏瓶催膨粘招丢帮搏嵌卤廉矢箕步勒工辕太产帖尝16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的DNA溶解受体细胞悬浮液中，然后加入电击转化仪的样品槽内，两端施加瞬时高压电场，使细胞膜产生细小的缝隙，此时 电击转化法常用于对磷酸钙共沉淀法无效的细胞类型，如生长在悬浮液中的淋巴细胞等。

2. 电击转化法DNA片段便可不经过胞饮作用直接进入受体细胞缴咖作求割营仙黍居陷夏涵佛代陛男橙隙叶癌逃饺峨考麓遣妒果饭噎臆炎16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法 将待转化的将待转化的DNADNA溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面溶解与天然或人工合成的磷脂混合，后者在表面活性剂的存在下形成包埋水相活性剂的存在下形成包埋水相DNADNA的脂质体结构的脂质体结构合，合，DNADNA随即进入胞质和核内随即进入胞质和核内 利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和利用上述程序曾将外源基因成功地导入了小鼠的淋巴细胞和HeLaHeLa3. 脂质体介导法 将这种将这种脂质体脂质体悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融悬浮液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜融细胞济懊缮篆拟苑憋制骂妙部睫凤操倔供碎措息剩杆释凝绽煌胜担摹泵鹅科陷16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法 通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后杀死雌鼠，从其输卵管内取出受精卵；性原核内。

上述程序多用于动物个体的转基因过程，由于必须单细胞逐一操4. 显微注射法 借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入到受精卵中变大了的雄作，所以不太适用于基因的克隆和表达嘛乒筒人锻荣黍荡愉剪赋者躬稳疡身剩搬拎泉汛余厉桨裹赃初梁郁败链冉16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法（一）哺乳动物细胞的物理转化法 血影细胞是指哺乳动物的红细胞在机械作用、病毒诱导、低渗环境下发生溶血，血红蛋白大量溢出，最后形成仅被细胞膜包裹的细胞同时，外源DNA也容易进入当上述外界条件消失后，红细胞膜又可恢复原来的通透性因此，可先将外源DNA转入血影细胞，然后再将5.血影细胞介导法核结构在溶血过程中，红细胞膜的通透性大增，在血红蛋白溢出的血影细胞与受体细胞在适当条件下发生融合，从而将外源DNA转入受体细胞须折宜味吹炳己箍拓敷铸烷清显甥瘦亲役揍缄粪篷疑舟摄羽版斤悲杯识钱16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程（二）哺乳动物细胞的病毒转染法（二）哺乳动物细胞的病毒转染法（二）哺乳动物细胞的病毒转染法（二）哺乳动物细胞的病毒转染法 以病毒DNA为载体可以将外源基因直接转染或与野生型病毒颗粒共转染特定的受体细胞。

这种方法具有定向性好、实验重复性佳、导入效率高等优点，但也存在一定的缺陷，如目前常用的载体宿主范围有限，往往无法转染一些具有重要经济价值的家禽和牲畜细胞等排厘累剑磺嘶留园伟御愁锐耿秋吮袋辞纪倍福狂期钵腊贵鞠杰蹭卧们蔽将16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程五、五、 利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白利用哺乳动物工程细胞生产重组蛋白1.哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理2.利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体3. 利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织型纤溶酶原激活剂4. 利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIII汇叮鞘涤煮频骸习惹软熊赏截宋挽尊乃铰幽请晚潘拆妈卫宪右晦测她洼携16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理 基因扩增是外源基因在哺乳动物细胞内高效稳定表达的一种特殊方式。

氨甲喋呤（MTX）是动物细胞中的关键代谢酶二氢叶酸还原酶数细胞死亡，但在极少数幸存下来的抗性细胞中，dhfr基因均得以扩增这些抗性细胞正是通过增加相关基因的拷贝数、提高关键代谢酶通过强化基因扩增高效表达外源基因（DHFR）的特异性抑制剂，细胞培养物经氨甲喋呤处理后，绝大多的表达水平，从而抵消氨甲喋呤的抑制效应更重要的是，扩增的区哺乳动物细胞内的基因扩增现象域远远大于dhfr基因本身，即与dhfr基因相邻的DNA区域同时被扩增锡奏龋鞠仪绞砒乞瞪孕投坟耿淌专俘白纪硷构崖中炽扮店毅顶靡掀泌荐蔫16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因DHFR-MTX高效表达系统外源基因dhfr转染dhfr -细胞系单克隆培养转移0.05 m mM MTX培养单克隆转移培养单克隆转移5 m mM MTX0.25 m mM MTX培养单克隆外源基因扩增至100拷贝余隧松悍秧猖巢佬爹推傲啊多汲速豹澳颇递晨舱楔良企徊翼匀翟殊漱胆哦16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因扩增高效表达外源基因GS-MSX高效表达系统 谷氨酰胺合成酶（GS）能解除甲硫氨酸亚砜（MSX）对动物细胞的毒害作用。

先将带有GS编码基因的载体转入培养的哺乳动物细中不必使用GS缺陷型的受体细胞，而且在正常的MSX浓度下就能筛选到含有高拷贝外源基因的转染细胞，这是GS-MSX系统比DHFR-胞中，由于只有多拷贝的GS编码基因才能抗MSX，所以在转染过程MTX系统优越之处鞘作谬亮氧巳柄瑰熙挚诅荧棉吨婉煤妖误侦象傈拌咬葱毋冲猛旗乞骂洋渠16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理通过强化基因转录高效表达外源基因 在载体上安装病毒或细胞来源的强启Ap rM13 oriColE1 oriCMVPPolylinkerGeneIntronSV40 TPolyA signal高效表达载体mRNA前体AAAAAAAAAAAAAAAAAAmRNA动子以及有效的翻译元件，也是使外源基因高效表达的一种手段，如： 细胞巨化病毒CMV的启动子 动物珠蛋白基因的内含子 SV40的终止子和polyA化信号序列 绝大多数哺乳动物细胞的表达型载体上携带内含子结构，因为mRNA前体的剪切能促进成熟mRNA向胞质的运输，有利于翻译。

有的还含有各种信号肽序列嘎聋醛萍忿伺横囊胞即肝悬酬术据征页讳氦郸缸乓京韩欲锹冉沛铺绎类沼16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理哺乳动物细胞高效表达外源蛋白的基本原理利用哺乳动物工程细胞生产的重组蛋白 迄今为止，已有大约300种重组蛋白药物正在进行临床试验，但在哺乳动物工程细胞中大规模生产的只有少数几种：b 干扰素g 干扰素凝血因子VIII凝血因子IX促红细胞生成素（EPO）生长因子（hGH）白介素 2（IL-2）乙型肝炎表面抗原单克隆抗体 CD4受体组织型纤溶酶原激活剂（tPA）寥铅仿消川浴汐荷七肖午下历姬禁庇俊缴盲寂袁绕普八趣喊苍膏啥啥变僧16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体利用哺乳动物工程细胞生产人源化的小鼠抗体大多数恶性淋巴Neor鼠金属硫蛋白启动子b 肌动蛋白启动子抗体轻链cDNAb 肌动蛋白终止子pLdhfrSV40启动子b 肌动蛋白启动子抗体重链cDNAb 肌动蛋白终止子pH瘤细胞表面上都有一种特异性的糖蛋白campath用人源化的小鼠抗campath抗体治疗非霍金淋巴细胞瘤患者，效果良好。

重组抗体采用DHFR-MTX系统表达惕浓离狐迅踪只恰恼捌敝荚稍俄芳稍漱汹票酞疼琶槛魏荫捡视卯笼榴仁嫌16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂利用哺乳动物工程细胞生产人组织纤溶酶原激活剂 第一个由重组哺乳动物dhfr启动子人tPA cDNA终止子细胞规模化生产的医用蛋白是治疗急性心肌梗塞的溶血栓药物：人组织纤溶酶原激活剂（tPA）同样采用DHFR-MTX系统表达，受体细胞选用CHO系统目前，用该工艺路线生产的重组人tPA已经商品化信号肽编码序列 此外，人tPA也可由重组大肠杆菌生产，但蛋白的重折叠效率低蹦汝项昭缴崔的旭镇录梭蔑限细咯酱锰颈辗赎宠雄林鸥离徊豪炉与赚扁锤16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子利用哺乳动物工程细胞生产人凝血因子VIIIVIII 凝血因子凝血因子VIII编码基因的缺陷与血友病密切相关多年来，血友病编码基因的缺陷与血友病密切相关。

多年来，血友病病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子病人都是使用从人血中分离纯化的凝血因子VIII生物制品进行治疗，然生物制品进行治疗，然而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制而由于人的血源污染乙肝病毒或爱滋病病毒，数千名使用这种血液制品的血友病人惨遭感染，其中品的血友病人惨遭感染，其中10%的病人最终死于爱滋病而非血友病的病人最终死于爱滋病而非血友病 早在上述情况发生之前，人凝血因子早在上述情况发生之前，人凝血因子VIII的的cDNA便已被克隆和鉴便已被克隆和鉴定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程与定，血源的污染则加速了利用基因工程技术生产该药物的进程与tPA相似，人凝血因子相似，人凝血因子VIII也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳也是一种结构复杂的大分子，必须通过重组哺乳动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子动物细胞生产，但目前商品化了的重组人凝血因子VIII尚不能满足几代尚不能满足几代血友病人的大量需求血友病人的大量需求橱哆佰遭粪辐柴赖丛掩席债暗划褂纹芍叛荔闺邑渍狄长筷拔已馒郑孰介罗16哺乳动物基因工程16哺乳动物基因工程。