肝脏干细胞研究进展姜润德 .doc

1肝脏干细胞研究进展姜润德 【关键词】肝 干细胞肿瘤人体持续更新的组织如骨髓、皮肤、肠粘膜上皮等存在干细胞池，通过干细胞不间断的增殖、分化来产生成熟细胞在肝脏，由于成熟的肝细胞仍然具备分裂、增殖的能力，肝组织内是否存在干细胞是一个长期以来颇有争议的问题近年来随着发育生物学尤其是干细胞生物学的飞速发展，肝脏干细胞的存在及其在肝脏疾病发生中的意义越来越受到了广泛的关注肝脏的多种病理生理过程可能与干细胞的异常增殖、分化密切相关；而肝脏干细胞的深入研究对于各种急、慢性肝脏疾病以及肝细胞癌的治疗也显示出了诱人的前景肝脏干细胞的认识以及围绕这一特殊干细胞的相关研究已经成为现代干细胞生物学和临床医学的研究热点之一1 肝脏干细胞的概念1.1 胚胎肝脏干细胞 人体胚胎发育早期，前肠末端的肝憩室演化为肝部和尾部两个部分，其中肝部生长极为迅速，至胚 5 周时已经充填于腹腔大部［1］ 这些向肝脏演化的胚胎样肝细胞我们称之为成肝细胞（Hepatoblasts） ，它不但具有旺盛的增殖能力，而且具有向肝细胞和胆管细胞分化的潜能［2］ ，所以成肝细胞实际上就是胚胎肝脏干细胞只有前肠末端在胚胎发育中可以被诱导成成肝2细胞。

4 个转录因子家族在肝细胞特定分化基因的表达中发挥了重要作用：①具有相同结构域的各种肝细胞核因子 1（hepatocyte nuclear factor 1,HNF1） ；②系列肝细胞核因子 3 蛋白（HNF3） ；③核受体超家族；④亮氨酸拉链家族（C/EBP） 靶细胞在上述转录因子的调控下，通过特定基因的表达而产生表型的改变胚胎肝脏干细胞的细胞标志包括分化标志如白蛋白（ALB） 、甲胎蛋白（AFP ）和系列细胞角蛋白（CK7 ， 8，9，14，18 ，19，20),相关的干细胞因子和受体如 Thy1、Flt3 、 SCF/ckit、OV6，髓源性干细胞标志如 CD34 等（表 1） Taniguchi 等［3 ］基于上述细胞标志用流式细胞分选法（FACS）成功地对胚胎肝脏干细胞进行了分离培养，分离的胚胎肝脏干细胞向同系动物肝脏移植可以分化成肝细胞和胆管上皮细胞，表明胚胎肝脏干细胞的确具有多向分化潜能1.2 成体肝脏干细胞 正常肝脏是否存在干细胞尚有争议有学者基于成熟肝细胞在肝损伤后可以不间断地恢复增殖能力的特点，提出肝脏本身就是一个“干细胞池”的观点然而根据干细胞的定义，干细胞除了具备分裂增殖能力以外，还应具备一定的分化潜能。

成熟肝细胞分裂产生的后代细胞仍然是成熟肝细胞，因此从严格意义上讲，成熟肝细胞不应被看作是干细胞3现在认为，在胆管树的末梢区域，即相当于组织学上的郝令氏管（canals of Hering）区，存在具有双向分化潜能的上皮细胞，可能是来源于胆小管周围、体积更小的“未定性（nondescript ） ”间质细胞在肝脏严重受损及/或成熟肝细胞的增殖受阻的情况下，它们可以异常激活、增殖，大量出现在肝小叶外周区域，组织学上表现为肝小叶周围体积较小、增殖活跃的细胞群体这些细胞核质比大，胞核圆形或卵圆形，被称之为肝卵圆形细胞（hepatic oval cells,HOC） 大量增殖的卵圆形细胞沿肝实质向肝小叶中央区迁移，分化成成熟的肝细胞，修复和重建肝脏与此同时，卵圆细胞也可以向胆管上皮细胞分化，参与肝内胆管的形成目前普遍认为，肝卵圆形细胞就是成体肝组织内的干细胞卵圆细胞被认为是肝脏干细胞的另外一个重要证据是，它与胚胎肝脏干细胞即成肝细胞具有相似的细胞标志，与造血干细胞具有一些共同的表面抗原（表 1） 诱导成体肝脏卵圆细胞的大量增殖有两个先决条件：其一，存在刺激肝组织再生的因素，在动物模型中常用的是大部分肝切除或毒物（如四氯化碳）引发的肝细胞坏死；其二，正常肝细胞的增殖受到抑制，动物实验中所用的抑制成熟肝细胞分裂的药物有 2 乙酰氨基芴（2acetylaminofluorene,2AAF） 、烟曲霉毒素B1（fumonisin B1,FB1） 、倒千里光碱性（retrorsine）或胆碱缺乏乙硫氨酸（cholinedeficient ethionine containing,CDE）饮食等。

4干细胞不执行分化细胞的功能，其功能是通过增殖产生成熟分化的细胞干细胞分裂产生的子代细胞只能在两种途径中选择其一：或者保持亲代特性，仍保持干细胞的身份；或者沿着特定的途径向终末分化表 1 成肝细胞、卵圆细胞、肝细胞、胆管上皮细胞及肝癌细胞的细胞标志 注：+：阳性；-：阴性；？：尚未确定 1.3 肝脏干细胞的多源性和可塑性 近年来，干细胞研究领域尤为激动人心的是成年个体多潜能祖细胞（multipotent adult progenitor cells,MAPCs）的发现肝脏干细胞可以来源于肝脏本身，但人体及动物实验均证实非肝源性干细胞可以向肝脏干细胞乃至成熟肝细胞分化离体的骨髓多潜能祖 细胞在体外培养过程中加入特定的生长因子，即可被诱导产生有特定表型的肝干细胞和肝细胞［4］ 在接受骨髓移植的病人和动物模型肝组织中可以发现带有供体基因标记的肝细胞已为若干研究所证实不同类型组织间干细胞的横向分化也有报道，如 Dabeva(1997)从大鼠胰腺组织分离出的上皮细胞移植至近交系大鼠肝脏后，发现该种细胞也可以分化成肝细胞，它们可以整合到肝小叶结构中并表达肝细胞特异性蛋白骨髓源性祖细胞是以什么样的身份经过血液循环到达肝脏尚不明确。

研究资料表明，骨髓内的细胞成分主要有造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSCs） 、间充质干细胞（ mesenchymal stem cells,MSCs）和内皮祖细胞（endothelial cell progenitors） 目前体内外实验证实造血干细胞（HSCs） ［5］和骨髓间充质干细胞（MSCs） ［6 ］均5可以分化成肝细胞肝脏卵圆细胞携带骨髓干细胞标记如CD34、Thy1、Fly3、SCF/ckit，尚不能说明它与造血干细胞有某种必然的联系骨髓内的多潜能祖细胞是在不同的微环境下获得了横向分化的（transdifferentiation）能力，还是它们本身就是更为原始的多分化潜能祖细胞尚不明确肝脏卵圆细胞具有可塑性卵圆细胞可以分化成胃肠道上皮细胞以及具有内分泌功能的胰腺细胞［7］ ；在脑组织，卵圆形细胞可以分化成神经细胞和神经胶质细胞［8］ ；在心脏，肝脏干细胞可以分化成心肌细胞［9］ Asakura［10］的研究发现，包括肝脏在内的若干个器官的干细胞可以分化成骨髓造血干细胞，Murase［11］对致死量照射的大鼠单纯实施肝移植后可以重建骨髓造血功能，与骨髓移植具有完全相同的救治效果。

有报道在接受肝移植治疗的病人，在随后移植肝中所发现的 B 细胞淋巴瘤为供体起源（瘤细胞具有供体的基因标志） ［12］ ；香港大学报道一类似病人，其移植肝中所发现的间叶样肉瘤也是供体起源［13］ Smith［14］等报道在临床肝移植伴发的移植物抗宿主反应（graftversushost disease,GVHD)中，可以发现宿主体内嵌合大量有免疫活性的供体起源的淋巴细胞这些异常增殖的淋巴细胞和间叶细胞起源于供体肝脏的细胞来源可能有二：其一，供肝离体后尽管实施了彻底的肝脏灌注，但仍然残留了部分造血干细胞，它们是起源于供肝中残存的血液/造血干细胞；其二，如果肝脏干细胞有足够高的可塑性，它6们也可能是起源于供肝中的多潜能祖细胞2 肝脏干细胞与肝脏疾病2.1 肝脏干细胞与急性肝损伤 肝脏损伤后再生反应发生的非常迅速、全面（残留的肝细胞均进入增殖状态） ，受控于精确的调控机制（各种生长因子、细胞因子和激素的协同作用） ，再生的同时又可行使其正常的生理功能（如解毒、胆汁分泌、糖原合成等） 动物实验和临床研究均已证实，急性肝损伤所诱发的肝组织再生主要由残存的正常肝细胞重新进入细胞周期而完成理论上，对于 2/3 肝切除的大鼠，残余的肝细胞平均经过 3/2 个细胞周期即可完成肝组织的再生，整个再生过程持续 1~2 周即可完成。

临床上肝部分切除和急性肝炎所导致的肝细胞坏死可能历经与动物模型相似的再生过程如果成熟肝细胞的分裂增殖受到抑制，抑或肝细胞的坏死范围过大，肝脏再生就不得不通过动员干细胞的增殖来完成在实验性肝再生模型上，可以清楚地观察到卵圆形细胞首先在肝小叶周围大量增殖，并随时间的推移逐渐向小叶内迁移临床上，对于急性大块肝坏死的组织学观察也发现，卵圆细胞首先出现在小叶周边的界板区域，大约在肝损伤的第 4 天，卵圆细胞转化为肝细胞72.2 肝脏干细胞与慢性病毒性肝炎 在临床实践中，急性肝组织的损伤与再生实际上并不是很多见，我们所经常面临的问题是慢性肝炎所造成的反复而持续的肝细胞损伤以及在这种状态下肝细胞的代偿性增殖在肝细胞内，HBV 病毒完成其自身的复制，甚或与肝细胞的基因组发生位点非特异性的整合同时，病毒基因利用肝细胞的蛋白合成装置装配病毒特异性蛋白病毒蛋白作为内源性抗原在肝细胞内加工处理后与 MHCI 类分子结合并被递呈至肝细胞表面，被 CTL特异性识别或通过 Fas 系统杀伤肝细胞假如，机体通过有效的免疫机制将病毒清除，代偿性再生完成后肝细胞不再被破坏，机体得以恢复然而，乙型（或丙型）肝炎的特点是病毒难以被清除，肝细胞的损伤与再生反复而持续存在，尤其是感染后期，成熟的肝细胞广泛地被病毒感染，而且被病毒感染的肝细胞常常失去增殖能力（组织化学显示有病毒抗原阳性的细胞 PCNA 极少阳性染色） ，干细胞的增殖分化便成为代偿性增殖主要细胞群体。

实验研究也证实，肝炎肝硬化病人，组织病理学发现在增生灶的周围有增殖状态的干细胞［15］ 肝脏干细胞主要存在于终末胆管，慢性肝炎（尤其是活动性肝炎）的组织学特点之一是汇管区及其周围的纤维结缔组织间隔出现大量的胆小管增生尽管我们对慢性肝炎肝纤维化的机理尚未弄清，但8纤维化的产生与肝脏干细胞的增殖似乎存在着某种必然的联系，病人血清高 AFP 水平也可能与干细胞的异常增殖有关2.3 肝脏干细胞与原发性肝癌 肿瘤学目前对肝细胞癌来源于成熟肝细胞的分化（dedifferentiation)，还是来源于干细胞的分化受阻（maturation arrest of stem cell differentiation）或失分化（dysdifferentiation) 意见不一去分化观点认为，致癌物作用的靶点是成熟的肝细胞，引起靶细胞基因突变及/或遗传物质的不稳定支持该学说的实验证据有：用逆转录病毒介导的基因转染标记成熟的肝细胞，在 2 乙酰氨基芴（2AAF）诱导的肝癌模型中，癌前病灶可以起源于成熟的肝细胞对人类肝癌而言，成熟肝细胞的去分化假说似乎是一种被普遍接受的观点目前人类肝癌的分子生物学研究主要围绕肿瘤相关基因的筛选以及病毒基因组的整合所可能引起的肝细胞基因组的突变或不稳定。

分化受阻假说认为，致癌物作用的靶点是干细胞分化成熟的微环境，各种导致该微环境结构异常及/或化学信使传递异常的因素是致癌作用的首要原因，肿瘤的本质是起源于组织内原已存在的干细胞的分化受阻［16］ 我们的研究也发现，慢性肝炎组织、肝硬化组织及癌旁肝组织可以高水平表达乙肝病毒蛋白产物，但在癌组织内，病毒抗原的表达却神秘消失，被病毒感染的肝细胞常常失去增殖活9性（PCNA 阴性） ，有增殖活性的细胞常常是肝小叶周边体积较小的“卵圆形细胞” ，即肝组织内的干细胞支持分化受阻学说的其它证据还有：肝恶性肿瘤组织内有卵圆细胞存在［17］ ；肝癌细胞和卵圆细胞表达相似的细胞标志如AFP，GGP ，细胞角蛋白系列 CK（7 ，8，18，19 ，20） ，转录因子 OC2、OC3，卵圆细胞标志 OV1、OV6，干细胞标志 SCF/ckit和 CD34；不少研究发现，肝癌细胞还表达 B 细胞分化抗原如CD10 和 CD40，但该抗原在卵圆细胞和成肝细。