肝脏和肌肉脂肪异位沉积与空腹高胰岛素血症的发生.doc

1肝脏和肌肉脂肪异位沉积与空腹高胰岛素血症的发生作者：马丽超，张莉，刘利兵，陈健康，焦凯 【摘要 】 目的： 研究高脂高糖饲养大鼠血浆游离脂肪酸和肝脏、肌肉甘油三酯沉积与胰岛素抵抗的关系. 方法： 健康雄性 9 周龄SD 大鼠 20 只，随机分为实验组(n=10)高脂高糖饲料饲养和对照组(n=10)普通饲料饲养. 实验 6 wk，比较 2 组大鼠血浆游离脂肪酸（FFA ）,血清胰岛素（ FINS）, 空腹血糖（ FPG）, 胰岛素抵抗指数（HOMA IR ）及肝脏甘油三酯（ TG）异位沉积的情况. 结果： 在实验 6 wk 与对照组比较，① FFA (mmoL/L, 0.74±0.04 vs 0.62±0.05, P<0.01)；② FINS(mU/L, 31.96±2.58 vs 12.64±1.35, P<0.01)；③ FBG (mmoL/L, 5.32±0.55 vs 5.12±0.47, P>0.01)；④ HOMA IR (7.57±1.11 vs 2.87±0.35, P<0.01)均升高；⑤ 体内脂肪相对含量 (g, 8.81±1.27 vs 6.65±0.88, P<0.01)；⑥ 油红染色病理切片计算机半定量分析，肝脏组织中 TG 含量高于正常对照组（99.5±4.7 vs 128.5±3.9, P<0.01） ，肌肉(127.6±3.1 vs 134.7±2.9, P<0.01)胰腺的 TG沉积无明显差异(P>0.05). 结论： 高脂高糖饲养可以诱导大鼠胰岛素抵抗，其胰岛素抵抗的形成与 FFA 的增加及肝脏和肌肉组织TG 异位沉积有关. 2【关键词】 高脂饮食；大鼠， Sprague Dawley；胰岛素抗药性；甘油三酯类0 引言胰岛素抵抗( insulin resistance, IR)是 2 型糖尿病（T2DM）发病的重要病理基础，而胰岛素抵抗的产生机制目前尚未完全阐明.最近研究证明游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）水平升高以及甘油三酯(triglyceride,TG)在非脂肪组织（例如肝脏、肌肉和胰腺）的异位沉积与 IR 的产生密切相关.我们利用高脂高糖饲养SD 大鼠建立胰岛素抵抗模型，探讨 TG 异位沉积与 IR 发生的关系.1 材料和方法1.1 材料清洁级雄性 SD 大鼠（第四军医大学动物实验中心）20 只，体质量 90～115 g ，分成实验组和对照组，每组 10 只，单笼饲养于 22℃和光照(08∶00～21∶00)的环境下. 实验组以高脂高糖饲料喂养（普通饲料 0.47，化猪油 0.23，蔗糖 0.21，蛋黄粉0.09，热量 22 kJ/g） ［1］建立胰岛素抵抗动物模型，对照组以普通饲料喂养.两组动物不限量饮食，每天称取饲料消耗量，每周禁食12h 后测体质量 1 次. 实验 6 wk 处死大鼠，取腹膜后及附睾处脂肪3组织称湿质量.1.2 方法两组大鼠每周经禁食 12 h 后剪尾取血 1 次，取血量约为 0.8 mL.空腹血糖用葡萄糖氧化酶法测定，胰岛素用放射免疫法测定（试剂盒由北京北免东雅公司生产） ，铜试剂显色法测定血浆FFA 浓度 .胰岛素抵抗以稳态模式胰岛素抵抗指数表示，常用的稳态模式评估法（Homeostasis Model Assessment, HOMA）HOMA IR＝（FPG×FINS ） /22.5［2］ （注： FPG 空腹血糖浓度mmoL/L，FINS 空腹胰岛素浓度 mIU/L）. 取肝脏、肌肉和胰腺组织，冰冻切片 5～10 um, 40 g/L 甲醛固定 10 min，蒸馏水稍洗，600 g/L 异丙醇漂洗 1 次 20～30 s，用油红 O 染色 10～15 min，经 600 g/L 异丙醇液分化后，水洗 1～2 min，用稀释 1 倍的明矾苏木精液淡染细胞核 1 min，甘油明胶封片.HE 染色观察组织形态结构. 使用计算机彩色图像分析系统灰度分析软件，对油红病理切片进行半定量分析，每组每只大鼠肝脏、肌肉和胰腺各取 3 张切片，每张病理切片取 5 个视野，记录每个视野灰度值，取平均值确定灰度值. 统计学处理：使用 SPSS 11.5 统计软件.实验结果以 x±s 表示，两组间比较采用两样本 t 检验. P<0.05 即认为具有统计学差异.42 结果2.1 大鼠血清生化指标变化 SD 大鼠实验 6 wk 血 FFA、血FINS 变化和 HOMA IR 两组有显著差异，两组血糖无差异（表1）.表 1 两组动物 6 wk 生化指标（略）bP<0.01 vs 对照组.2.26 wk 内脏脂肪改变在实验 6 wk，油红脂肪染色法，实验组大鼠肝脏出现中重度弥漫性脂肪变性，肝细胞增大，肝窦受压变窄甚至消失，肝索排列紊乱，部分尚可见肝细胞水肿等现象（图1）. 利用油红 O 染色的病理切片，在计算机彩色图像分析系统上进行灰度分析（灰度值越小，油红染色越深，脂肪沉积面积越大，强度越大） ，测定各组织 TG 沉积相对面积和相对强度显示，正常组6wk 肝细胞内有少量脂滴，而高脂喂养组肝脏脂变面积明显增加，灰度分析显示两组差异显著（P<0.01 ，表 2）.A： 实验；B： 对照.图 1 肝脏实验 6 wk×20（略）5表 2 两组大鼠 6 wk 体脂和油红染色的切片灰度分析（略）bP<0.01 vs 对照.3 讨论遗传、环境和代谢因素可导致 IR、胰腺 β 细胞功能障碍以及T2DM，但机制仍不完全清楚.有研究表明脂肪组织和机体的脂肪动员与 IR 关系密切［ 3-4］ ，由于脂肪代谢异常导致的非脂肪组织如肝脏、肌肉的 FFA 流增加，可导致和加重 IR 和 T2DM 代谢紊乱表现.FFA 浓度可以反映体内的脂肪动员情况，其中来自于内脏脂肪库的FFA，是 FFA 流增高的主要部分. 在人类，细胞质 TG 沉积与 IR 相关［5-8 ］ ，但其精确机制还不清楚.TG 的异位沉积可能是导致 IR 的原因之一.我们利用高脂高糖饮食喂养大鼠，观察肝脏、肌肉和胰腺等非脂肪组织 TG 的沉积情况，以探讨早期脂肪异位沉积与 IR 的关系. 在第 6 wk，实验组大鼠与对照组比较内脏脂肪组织显著增加，FINS 和 FFA 明显升高，HOMA－IR 明显增加，提示 IR 的形成.各组织油红染色病理结果显示，肝脏脂变面积明显增加(P<0.01),肌肉组织有部分 TG 沉积. 而胰腺组织没有明显 TG 沉积，提示肝脏和肌肉的早期异位沉积与 IR 形成相关.实验组的血清 FFA 浓度和HOMA IR 都升高，提示 FFA 与 IR 有关，但其中的因果关系尚不6清楚. 本实验结果显示，高脂喂养早期即第 6 wk，TG 分布异常尤以肝脏明显，同时存在 IR. 提示 TG 在肝脏沉积与 FINS 升高关系密切，可能在 IR 产生过程中发挥重要作用.肝细胞脂肪变性是指肝细胞脂质含量增多，在胰岛素抵抗和 T2DM 中常见［9］.有文献报道［10］ ，肌肉 TG 沉积和 IR 存在密切关系，但是具体机制还不清楚. 我们发现，高脂喂养的早期阶段，肌肉的 TG 沉积明显，表明肌肉TG 的沉积在 IR 形成的早期阶段的作用可能很重要 .还有研究认为，FFA 流入胰腺组织，超过其氧化能力，FFA 酯化为 TG 会导致胰腺的功能亢进或者功能异常，导致 β 细胞的损害，影响了胰岛素分泌造成 IR.但是我们发现，高脂喂养早期阶段，胰腺的 TG 沉积并不明显，胰腺胰岛素分泌的功能还没有明显的受到 TG 的影响，胰腺的TG 异位沉积在 IR 形成早期阶段似乎并不起决定性的作用 .有研究提出了肝细胞胰岛素抵抗和脂肪变的新机制，大鼠高脂饮食喂养 3 d，就会出现肝细胞胰岛素抵抗和脂肪变，因为这种干预诱导肝细胞甘油三酯增加 3 倍与本文献一致［ 11］ . 但是，胰腺 TG 沉积与 IR关系密切，尚需更进一步的研究.本实验胰腺 TG 的早期异位沉积不明显，暗示肝脏和肌肉异位沉积在 IR 的产生中起着重要的作用，其原因还有待研究.【参考文献】7［1］ 潘玲，刘继林，王建. 实验性胰岛素抵抗综合征大鼠模型［J］. 华西医学,2000,15:421.［2］ Matthews DR，Hosker JP，Rudenski AS,et al. Homeostasis model assessment :insulin resistance and beta cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man［J］. Diabetologia,1985,28:412-419.［3］ Guerre Millo M. Adipose tissue and adipokines: for better or worse［J ］. Diabetes Metab, 2004,30:13.［4］ Kershaw EE, Flier JS. Adipose tissue as an endocrine organ［J］. J Clin Endocrinol Metab, 2004,89:2548.［5］ Phillips DI, Caddy S, Ilic V, et al. Intramuscular triglyceride and muscle insulin sensitivity: evidence for a relationship in nondiabetic subjects［J］. Metabolism,1996,45:947-950.［6］ Goodpaster BH, Thaete FL, Simoneau JA, et al. Subcutaneous abdominal fat and thigh muscle composition predict insulin sensitivity independently of visceral fat［J ］. 8Diabetes,1997,46:1579-1585.［7］ Pan DA, Lillioja S, Kriketos AD, et al. Skeletal muscle triglyceride levels are inversely related to insulin action［J］. Diabetes,1997,46:983-988.［8］ Krssak M, Petersen KF, Bergeron R,et al. Intramuscular glycogen and intramyocellular lipid utilization during prolonged exercise and recovery in man: a 13C and 1H nuclear magnetic resonance spectroscopy study［J］. J Clin Endocrinol Metab, 2000,85:748-754.［9］ Kelley DE, Mandarino LJ .Fuel selection in human skeletal muscle in insulin resistance: a reexamination［J］. Diabetes, 2000,49:677-683.［10］ Lewis GF, Carpentier A, Adeli K,et al. Disordered fat storage and mobilization in the pathogenesis of insulin resistance and type 2 Diabetes［J］. Endocr Rev ,2002,23(2):201-229.［11］ Samuel VT,Liu ZX, Qu X, et al. 。