临床医学论文 rAdp53的抑癌作用及体外转染后抑癌蛋白的表达.doc

临床医学论文・rAd p53的抑癌作用及体外转染后抑癌蛋白的表达作者：王建华，纪宗正，闫立昆【摘要】 H的为了了解重组人p53腺病毒注射液（商品名“今乂生”）对大 肠癌174细胞株的体外抑制作用及其半数致死量（IC50）,更好地指导临床应 用方法通过体外细胞培养、利用MTT法对比检测重组人p53腺病毒注射液与 5 氟腺“密噪、替加氟、顺钳、奥沙利钳、丝裂霉索以及紫杉醇等大肠癌常用化 疗药物的IC50,明确重组人p53腺病毒注射液体外抑瘤活性的强弱；利用免疫 组化检测技术检测重组人p53腺病毒体外转染大肠癌174细胞株后，细胞凋亡、 生长抑制与细胞内p53蛋白表达情况之间的关系结果重组人p53腺病毒注射 液具有良好的体外抑瘤效应,IC50为5.73X1011VP,且有剂量和时间依赖性;但其单用吋的体外抑癌远远逊于经典的化疗药物如丝裂霉索、5 氟腺喳噪和顺 钠等；五种不同滴度的重组人p53腺病毒注射液在体外大肠癌174细胞株转染 过程中皆出现了阳性染色结果，最早的阳性染色结果出现在p53基因转染24小 时后，而空白对照组的免疫组化染色皆为阴性结论 重组人p53腺病毒注射液 具有明确的体外抑瘤效应，且有剂量和时间依赖性；但其单用时的体外174 细胞株的作用低于丝裂霉索、5 氧尿“密噪和顺钳。

关键词】 重组人p53腺病毒；细胞培养；MTT检测；基因转染；免疫组织 化学Abstract： Objective To understand the inhibition and IC50 （50%inhibiting concentration) of the recombinant adenoviral p53 gene (rAdp53) for the colorectal cancer cells in vitro and to guide clinical practice. Mclhods We evaluate the efficiency (IC50) of the rAd p53 and six kind of anti cancer drugs (5 fluorouracil, tegafur, mitomycin c, cisplatin, oxal iplat in, paclitaxel) for human colorectal cancer eel 1 1 inc174 through the cell culture and MTT chemosensiIivity assay to make sure the ant i cancer capabi 1 i ty of rAd p53・ Expression of p53 protein in t ransfect ion eel 1 s of colorectal cancer 1 ine 174 wi th rAd p53 was evaluated by immunohistochemica 1 stain. Results The rAd p53 has good anti cancer efficacy for the colorectal cancer cell 1 inc 174 in vitro, i t s TC5O i s 5.73X 1011 VP (viral part icles) and i t i s dose dependent and t ime dependent ・ But its anti cancer efficacy can' t be compared wi th the classical chemical medicine mi tomycin c, 5 fluorouraci1 and cisplatin et al when it used alone・ The immunohistochemistry stain in blank control group is negative. However five different density of rAdp53 are al 1 appeared posilive resulI in infected colorectal cancer cells with rAd p53 and earliest positive result presented at 24 hours after infect ion .Conclusion The rAd p53 has good ant i cancer efficacy for the colorectal cancer cell line 174 in vitro, it is dose and timedependent manner・ But its ant i cancer efficacy worse than those of the classical chemical medicine mitomycin c, 5 fluorouraci1 and cisplatin etc. when it was used alone.Key words： rAd p53； Cel 1 culture； MTT assay； Gene transfection；Immunohistochemistry stain0引言IT前-肿瘤基因治疗领域中研究最多的就是“人类基因组保护神”——抑癌基 因p53。

p53基因的改变，包括突变和(或)功能异常是肿瘤发生过程小最为常 见的遗传变异[1,2],尤其在结肠癌中更高达75%[3]o 2004年我国率先将世界 上第一种基因治疗药物——重组人p53腺病毒注射液(rAdp53 injection)应用 于头颈部肿瘤患者的临床治疗为了对比了解该注射液对大肠癌细胞株的体外生 长抑制作用我们进行了如下试验1材料与方法1.1实验材料1.1.1实验肿瘤细胞株人肠癌174细胞株由西安交通人学医学院病理教研室王一理教授惠赠，最佳细胞接种浓度为(1.5-5.0) X104/mL对数生长期为接种后的3〜5天[4]1.1.2重组人p53腺病毒注射液(rAd p53)深圳赛百诺基因技术有限公司产品，为同源重组人p53腺病毒1.2方法1.2.1重组人P53腺病毒及临床常用化疗药物对大肠癌细胞体外生长抑制的对比测定(曝卩坐蓝比色法，即MTT法)利用细胞存活率(细胞存活率二试验 组光吸收值/对照组光吸收值X100%）对约物剂量对数作图并按作图法ynx+b 求出实验药物的TC50[5]o1.2.2消化、稀释、接种0.25%的胰蛋白酶（GIBCO公司）消化大肠癌174细胞株，并用含10%新生 牛血清（北京鼎国）的RPMI 1640 （GIBCO公司）培养液稀释成浓度为5X104 个/ml均匀的单细胞悬液，将其以每孔200 u 1接种于96孔培养板（美国COSTAR）, 置于细胞孵育箱（美国NUAIRE）,在3TC、5KO2及饱和湿度条件下进行培养。

1.2.3基因转染72h后实验组（共设3个浓度，每浓度设平行孔3个）每孔加入重组人p53 腺病毒液100 u 1,浓度分别为1X1010VP、1X1O9VP> 1X108VP；对照组每孔加 入生理盐水lOOu 1,连续测定96ho1.2.4显色分别于转染后12、24、48、72、96h终止实验在终止实验前4h,于每 孔加入MTT 20 u 1（GIBCO公司），继续培养4h后终止培养，吸弃上清液，每孔 加入DMSO 150u 1 （西安化学^制剂厂），水平振荡仪振荡lOmin,倒置显微镜卜观察细胞内蓝紫色结晶完全溶解，形成均匀的蓝紫色溶液1.2.5比色测定选择450nm> 630nm双波长，在酶联免疫检测仪（香港DENLEY DRAGON 352）上测定各孔光吸收值，记录结果，并计算药物的Tmax%（Survival rate maximal inhibi lion）和 IC50（50% Inhibi t ion concent rat ion）,用以比较不同 化疗药物的体外抑瘤效应同吋测定其它6种常用化疗药物的Imax%、IC50以 便与rAd p53对比，了解其抑癌活性的强弱1.2.6免疫组化法检测rAd p53体外转染大肠癌细胞后相关蛋白的表达 情况（1）消化、稀释、接种：同样将大肠癌174细胞株，以每孔3X104个细 胞的密度接种于预置有圆玻片（经多聚赖氨酸浸泡、高压灭菌预处理）的12孔 细胞培养板中并置于细胞孵育箱中培养。

2）转染：72h后细胞生长良好，全 部附于玻片上分别以 1X1011VP/孔、1X1010VP/孔、1X109VP/孔、1X108VP/ 孔、1X107VP/孔加A rAd p53,在转染后 1、2、6、12、24、48、72、96h 捞 出玻片，并以4°C无水乙醇固定lOmin, PBS冲洗3遍，自然晾干实验过程中 设置空白对照组，仅加入生理盐水100u 1,不给予rAd P53o （3）免疫组化 检测：每张玻片滴加50u 1 3%H2O2,室温下孵育lOmino PBS冲洗3X3min滴 加一抗50 u 1 （鼠抗人p53单克隆抗体，北京中杉金桥）,37°C孵育60mino PBS 冲洗3X3mino滴加二抗50,（即用型羊抗鼠IgG/HRP多聚体，北京中杉金桥）, 37°C孵育15mino PBS冲洗3X3min滴加100 u 1 DAB溶液，显微镜下观察显色 流水冲洗，苏木素复染二甲苯透明后封片2结果按体外MTT检测结果，以细胞存活率为纵轴结合浓度的对数值绘制大肠癌 174细胞株在rAd p53作用下的细胞生长抑制曲线见图1从曲线看不同浓度对大肠癌细胞生长抑制作用不同，随浓度变化抑制作用呈现正相关性剂量效应关 系；同样，随药物作用时间的延长其对细胞的生长抑制也呈正相关吋间效应关系。

利用作图法 y=ax+b 计算 rAdp53 的 IC50 为 5.73X 1011VP/mloTmax%代表了化疗药物达到最人抑制吋，残存肿瘤细胞的存活率Imax%越人, 表示残存的肿瘤细胞越多，纱物的肿瘤抑制效应越小不同「药物之间的Imax%存 在着明显的差异表1列出了大肠癌174细胞株对重组p53腺病毒及大肠癌常用 的6种化疗药物Irnax%的对比表1重组p53腺病毒与6种常用化疗药物对大 肠癌174细胞株的Imax%^比（略）表2大肠癌174细胞株对重组p53腺病毒 及常用化疗药物IC50的比较（略）由此可以看出，10倍临床血浆峰浓度时丝裂霉素的抑瘤效应最强；1倍临床 血浆峰浓度时5 氟尿“密噪抑瘤效果最强；0.1倍临床血浆峰浓度时紫杉醇抑瘤 效果最强由此推论丝裂霉素、顺钳、奥沙利钳等随着浓度的增加体外抑瘤效果 也在增强即表现出良好的剂量依赖效应；紫杉醇、5氟尿“密喘等则在0.1倍临 床血浆峰浓度吋表现良好的抑瘤效果即敏感性最好以药物达到最大抑瘤效应一半吋所需的药物浓度TC50,來比较大肠癌174 细胞株对不同纱物的敏感性IC50越小，表示肿瘤细胞对化疗线物的敏感性越 大;反之则表示敏感性越小。

表3列出了大肠癌174细胞株对重组p53腺病毒及 大肠癌常用的6种化疗药物的IC50（50% inhibiling concentration）数值从表2可以看出同等条件下，重组p53腺病毒抑制大肠癌174细胞株的效 应并不强，按IC50而言5氟腺卩密噪、紫杉醇、丝裂霉素的作用最强，5氟 服喘噪仅需要临床血浆峰浓度的0.28倍即可以达到受试细胞的半数抑制；顺钳、 奥沙利钳的抑制肿瘤细胞生长的作用较前者弱，但明显强于重组p53腺病毒、替 加氟的作用基因转染后免疫组化染色结果如图2〜75种不同滴。