荧光原位杂交(FISH)实验步骤.doc

仪器设备1、医用微波炉；2、水浴锅；3、OLYMPUSBX51荧光显微镜；4、OLYMPUSDP11数字显微照相机FISH试剂(1) 1XPBS:由10XPBS溶液稀释而成，储存于4°C；(2) 20XSSC(pH7.0)；(3) 2XSSC，由20XSSC溶液稀释而成；(4) 25mg/ml蛋白酶K消化液5) 变性液(70%甲酰胺+2XSSC,pH7.0)：4ml20XSSC；8ml蒸馏水；28ml甲酰胺每次新鲜配制6) 杂交后洗涤液：20XSSC4ml；蒸馏水16ml；甲酰胺20ml每次新鲜配制调节pH前升至室温实验步骤1、脱蜡：1) 二甲苯脱蜡3次，每次5min；2) 100%酒精两次，每次2min；3) 移出酒精，斜置切片，标记末段向下，空气干燥2、蛋白酶处理:1) 每个染色缸40ml蛋白酶K消化溶液，配制方法如下：2XSSC40ml倒人Facal管，在水浴槽中预热将消化酶液加入管内，摇动直到酶溶解2) 37C水浴槽中预热染色缸和蛋白酶K溶液°37C孵育20min3) XSSC在室温下漂洗切片3次，每次1min4) 梯度酒精脱水(-20C预冷)3、变性：1) 每一个立式染色缸配制40ml变性溶液；2) 78C水浴槽中平衡预热混合液染色缸；3) 78C孵育8min；4) 即移入-20C预冷70%酒精的染色缸内2min，再依次移入80%、90%和100%的-20C预冷酒精内，每缸2min；5) 空气干燥。

4、杂交：1) 准备探针；2) 取一个较大的湿盒，交叉放置切片；3) 滴10口l探针在切片的组织上，加盖玻片；4) 盖上湿盒盖，37C孵育12h〜16h杂交后的水洗：5) 镊子小心去除盖玻片；6) 43C预热杂交后水洗溶液40ml水洗切片15min；7) 2XSSC(37C)洗两次，每次10min；8) 切片放人染色缸的1XPBS内待检测，勿使切片干燥检测：9）从1XPBS中取出切片，除去过多的水分，避免标本干燥把切片放入湿盒内，同时处理4张切片10）每张切片使用30口l〜60口l罗丹明抗-地高辛抗体或FITC卵白素，室温下孵育20min；11）去掉塑料盖膜，把切片放入含1XPBS的染色缸1XPBS室温下洗3次，每次2min扩增：12）从1XPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；13）每张切片滴30口l〜60口l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；14）去掉塑料盖膜，把切片放人含1XPBS的染色缸1XPBS室温下洗3次，每次2min；15）从1XPBS中取出切片，斜置切片使液体排出；16）每张切片滴30口l〜60口l抗-卵白素抗体，加塑料盖膜，室温孵育20min；17）1XPBS室温下洗3次，每次2min。

5、细胞核染色：1）张切片加10口l〜20口lDAPI，覆盖盖玻片并在室温下孵育2〜5ml；2）尽可能快的在荧光显微镜下观察或封闭盒内保存在-20°C冰箱切片在染色之后1h内可以在显微镜下观察PRINS步骤1、常规脱蜡浸入0.01mol/LPBS；2、用0.2mol/L盐酸处理5min；3、蛋白酶K（25ug/m1）消化37C15min；4、分别用80％，95％和100％酒精脱水，室温干片；5、加PCR混合液25uL（10mmol/LTris-HCl，50mmol/LKCl，1.5mmol/LMgCl2,各加200口mol/LdATP，dCTP，dGTP，1.5mmol/Ldig-11-dUTPl.5ul，引物250ng，TaqDNA聚合酶2U），加盖片；6、94C变性5min后置入65C湿盒中5min；7、用0.1XSSC液，65C洗5min；8、片于65C10s〜20s；用4XSSC-0.1%吐温20液42C洗5min,2次；9、经BufferI液洗后滴加20%羊血清封闭30min；10、加地高辛抗体复合物（1:500）室温下2h；11、BufferIII液洗5min；12、用BCIP-NBT显色1h〜2h,在镜下控制，终止显色；13、用中性红或核固红衬染，酒精脱水，二甲苯透明，树脂封片。