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第五节第五节  基因工程菌的稳定性基因工程菌的稳定性基因工程菌在传代过程中会出现质粒不稳定景象，包括分裂不稳定和构造不稳定质粒不稳定产生的缘由：质粒不稳定产生的缘由：1.含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率含质粒菌产生不含质粒子代菌的频率2.含质粒和不含质粒菌的比生长速率差别的大小含质粒和不含质粒菌的比生长速率差别的大小3. 细胞中所含质粒载体的拷贝数：细胞中所含质粒载体的拷贝数： 拷贝数差别不大时，质粒载拷贝数差别不大时，质粒载体相对地稳定；拷贝数相差悬殊，那么很容易呵斥一些细胞丧体相对地稳定；拷贝数相差悬殊，那么很容易呵斥一些细胞丧失质粒，并逐渐开展为优势群体失质粒，并逐渐开展为优势群体    4.宿主细胞宿主细胞DNA重组系统的作用：重组系统的作用： 质粒载体之间发生重组会构质粒载体之间发生重组会构成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体，其稳定成二聚体、三聚体，甚至四聚体等所谓的质粒寡聚体，其稳定性比单体差质粒载体中外源性比单体差质粒载体中外源DNA片段的大小同质粒寡聚化的片段的大小同质粒寡聚化的程度也亲密相关程度也亲密相关5.质粒的拷贝数除与工程菌本身的特性有关外，还与培育条件质粒的拷贝数除与工程菌本身的特性有关外，还与培育条件有关。

有关1.含低拷贝质粒数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率大，添加拷贝数能提高质粒的稳定性2.含高拷贝质粒数的工程菌产生不含质粒子代菌的频率较低，但大量外源质粒的存在使含质粒菌的比生长速率明显低于不含质粒菌，而不含质粒菌一旦产生，能较快取代含质粒菌而成为优势菌，所以对这类菌不能简单地采取提高质粒拷贝数的方法高拷贝质粒菌中质粒拷贝数添加与产物添加往往不成正比，这能够是含高拷贝质粒菌中，蛋白合成的限速步骤是转录和翻译，基因的大量复制加重了转录和翻译的负担，使得蛋白质合成速度变慢质粒稳定性的分析方法：质粒稳定性的分析方法：工程菌涂布不含抗性平板随机挑取100个菌落稀释10~12h接种含抗性的平板10~12h菌落计数提高质粒稳定性的方法：提高质粒稳定性的方法：1.两阶段培育法可有助于提高基因工程菌的稳定性2.在培育基中参与选择压力，如抗生素，也可抑制质粒的丧失3.采用适当的操作方法可使工程菌生长速率具有优势，并使工程菌和质粒丧失菌生长竞争趋于极端化第六节第六节  基因工程菌生长代谢的特点基因工程菌生长代谢的特点一、菌体生长与能量的关系：菌体生长由呼吸控制，各种碳源经过有限的呼吸才干所能提供的最大能量决议了菌体在培育基中的最大比生长速率当菌体生长所需能量大于菌体有氧代谢所能提供的能量时，菌体常会产生乙酸，乙酸会对菌体的生长起抑制造用。

乙酸的产生是由于供能缺乏，菌体将乙酰辅酶A转变为乙酰来供能采取各种方法，控制菌体的糖酵解速度，使之低于三羧酸循环和呼吸链的最大代谢才干，防止乙酰辅酶A和乙酸的产生经过代谢工程，提高菌体摄氧才干，可减少乙酸的生成如在大肠杆菌中表达有摄氧才干的细菌血红蛋白〔VHB〕，可提高菌体的氧摄取才干减少乙酸的方法：减少乙酸的方法：二、菌体生长与前体供应的关系二、菌体生长与前体供应的关系在根底培育基中参与氨基酸能使菌体比生长速率提高，蛋白合成添加在同样培育基中，工程菌的生长速度低于其宿主菌的生长速度，特别是工程菌诱导后外源基因的表达一同菌体生长速率下降，甚至停顿生长〔1〕前体供应缺乏时，会产生“严紧反响〞，氨酰tRNA缺乏，核糖体在密码子上停留，产生调控物ppGpp，使RNA聚合酶在模板上挪动产生停顿，mRNA和rRNA减少，核糖体合成减少〔2〕核糖体数量减少，那么减少了氨酰tRNA的缺乏，减少了核糖体在肽链延伸时的停顿和ppGpp的合成，在较低的比生长速率下到达平衡第七节第七节  基因工程菌发酵基因工程菌发酵一、基因工程菌的培育方式一、基因工程菌的培育方式1.补料分批培育补料分批培育:为坚持基因工程菌生长所需的良好微环境，为坚持基因工程菌生长所需的良好微环境，延伸生长对数期，获得高密度菌体，间歇延续地补加新颖延伸生长对数期，获得高密度菌体，间歇延续地补加新颖培育基，使菌体进一步生长的方法。

培育基，使菌体进一步生长的方法2.延续培育：由于基因工程菌的不稳定性，延续培育很难做延续培育：由于基因工程菌的不稳定性，延续培育很难做到3.透析培育：将培育基用半透膜进展透析，去除其中对菌生透析培育：将培育基用半透膜进展透析，去除其中对菌生长有抑制的物质长有抑制的物质4.固定化培育：可提高质粒的稳定性固定化培育：可提高质粒的稳定性二、基因工程菌的发酵工艺二、基因工程菌的发酵工艺〔〔1〕培育基的组成〕培育基的组成C源：如运用葡萄糖，那么要防止对源：如运用葡萄糖，那么要防止对Lac支配子的影响支配子的影响N源：常运用酪蛋白水解物，另外胰蛋白胨、牛肉膏、源：常运用酪蛋白水解物，另外胰蛋白胨、牛肉膏、玉米浆也为常用玉米浆也为常用N源〔2〕以pET载体、大肠杆菌BL21(DE3)为例，常用的发酵培育基有：LB培育基：蛋白胨：10g/L；酵母提取物：5g/L；NaCl：10g/L玉米浆培育基：玉米浆 2.5%，牛肉膏 1.5%，谷氨酸钠 1%玉米浆 2.5%，牛肉膏 1.5%，谷氨酸钠 1% 1.1.培育基的影响培育基的影响培育基的影响培育基的影响2.接种量的影响：影响发酵的产量和发酵周期，接种量小，延伸菌体延迟期，不利于外源基因表达，采用大接种量，有利于缩短延迟期，并能减少污染。

3.3.温度的影响：温度的影响：温度的影响：温度的影响：〔〔〔〔1 1〕温度扩增敏感型质粒，对此类工程菌，先在较低温度〕温度扩增敏感型质粒，对此类工程菌，先在较低温度〕温度扩增敏感型质粒，对此类工程菌，先在较低温度〕温度扩增敏感型质粒，对此类工程菌，先在较低温度下培育，然后升温，以大量添加质粒拷贝数，诱导外源基下培育，然后升温，以大量添加质粒拷贝数，诱导外源基下培育，然后升温，以大量添加质粒拷贝数，诱导外源基下培育，然后升温，以大量添加质粒拷贝数，诱导外源基因表达〔〔〔〔2 2〕温度影响蛋白质的活性和包含体的构成如表达〕温度影响蛋白质的活性和包含体的构成如表达〕温度影响蛋白质的活性和包含体的构成如表达〕温度影响蛋白质的活性和包含体的构成如表达GM-GM-CSFCSF的工程菌，在的工程菌，在的工程菌，在的工程菌，在3030度表达量最大，而在度表达量最大，而在度表达量最大，而在度表达量最大，而在3737度，由于细菌度，由于细菌度，由于细菌度，由于细菌热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，导致表达产物热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，导致表达产物热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，导致表达产物热休克系统被激活，大量的蛋白酶被诱导，导致表达产物被降解。

表达人被降解表达人被降解表达人被降解表达人GHGH的工程菌，的工程菌，的工程菌，的工程菌，3030度为可溶，度为可溶，度为可溶，度为可溶，3737度成包含体度成包含体度成包含体度成包含体4.溶氧量的影响：工程菌中外源基因的表达需求大量的能量，促进了细胞的呼吸作用，提高对氧气的需求，因此维持较高的程度的溶氧量〔≥40%〕才干提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白的表达5.诱导时机的影响：普通在对数生长期或对数生长后期诱导表达，此时菌群数目倍增，对营养和氧需求激增，营养和氧成了菌群旺盛代谢的限制要素6.pH6.pH的影响的影响的影响的影响可溶性蛋白，诱导后2，3，4，5，6小时后，目的蛋白的表达量包含体，诱导后2，3，4，5，6小时目的交融蛋白表达量第第八八节节基基因因工工程程药药物物的的分分别别纯纯化化〔三〕初步分别〔三〕初步分别 1. 1.分别细胞器：离心，超离心分别细胞器：离心，超离心 2. 2.除核酸：酶法除核酸：酶法DNase,RNaseDNase,RNase；超声；超声 3. 3.除脂肪：丙酮，脂肪酶除脂肪：丙酮，脂肪酶〔四〕粗分蛋白〔四〕粗分蛋白 1. 1.盐析：盐析：NaClNaCl，，(NH4)2SO4(NH4)2SO4沉淀沉淀 2. 2.有机溶剂抽提：甲醇，乙醇，丙酮有机溶剂抽提：甲醇，乙醇，丙酮 3. 3.等电点沉淀：除去杂蛋白等电点沉淀：除去杂蛋白 4. 4.热变性：除去杂蛋白热变性：除去杂蛋白〔五〕除盐〔五〕除盐 1. 1.超滤超滤 2. 2.凝胶过滤凝胶过滤 3. 3.冻干冻干 4 4 4 4 层析普通步骤：层析普通步骤：层析普通步骤：层析普通步骤： 处置介质↓装柱↓平衡↓上样↓洗涤↓洗脱↓介质再生3 3 留意问题：留意问题： (1) (1) 缓冲液的选择：缓冲液的选择： 阳离子：阳离子：TrisTris 阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐阴离子：磷酸盐，柠檬酸盐 (2) (2) 介质处置：介质处置： 阳离子：阳离子： Na+ Na+ 型型 阴离子：阴离子： Cl- Cl- 型型 (3) (3) 洗脱：洗脱：原理：原理：i i改动盐浓度改动盐浓度 ii ii改动改动pHpH值值方式：方式：i i延续洗脱延续洗脱 ii ii梯度洗脱梯度洗脱 (4) (4) 介质再生介质再生非蛋白质类杂质的去除：非蛋白质类杂质的去除：〔〔1〕〕DNA的去除：采用阴离子交换或疏水的去除：采用阴离子交换或疏水层析去除层析去除〔〔2〕去热源：消费过程中要作到无菌，在低〕去热源：消费过程中要作到无菌，在低温下操作，最后产品要经过过滤灭菌。

采用温下操作，最后产品要经过过滤灭菌采用阴离子交换、疏水层析、或亲和层析可去除阴离子交换、疏水层析、或亲和层析可去除热源物质热源物质〔〔3〕病毒的去除：色谱分别或过滤能去除病〕病毒的去除：色谱分别或过滤能去除病毒第九节第九节  基因工程药物的质量控制基因工程药物的质量控制一、原资料的质量控制：确保编码药品的DNA序列的正确性，重组微生物来自单一克隆，所用质粒纯而稳定，以保证产质量量的平安性和一致性见PAGE 100~101二、培育过程的质量控制：见二、培育过程的质量控制：见page 101三、纯化工艺过程的质量控制：见page101四、目的产品的质量控制：鉴别、纯度、活性、平安性、一致四、目的产品的质量控制：鉴别、纯度、活性、平安性、一致性1.产品的鉴别：〔1〕肽图分析：用酶法或化学法降解目的蛋白质，对生成的肽段进展分别分析该法是检测蛋白质一级构造中细微变化的最有效方法，蛋白质降解构成的肽段可经过测定氨基酸组成、N端序列或采用HPLC-MS或毛细管电泳等方法进展鉴定并与规范品比较〔2〕氨基酸成分分析：蛋白质在酸性或碱性条件下水解后，用氨基酸分析仪进展组成分析留意：碱水解会引起精氨酸、胱氨酸及部分赖氨酸被破坏 ；酸水解条件下，色氨酸、酪氨酸易被破坏 。

〔3〕部分氨基酸序列分析：测定N端15个氨基酸，作为重组蛋白质和多肽的重要鉴定目的〔4〕重组蛋白质的浓度测定：双缩脲法、常用染料〔如R-250或G-250〕结合比色法、福林-酚法、紫外分光光度法〔5〕重组蛋白相对分子量的测定：分子筛法、SDS-PAGE法、质谱法运用这些方法可判别重组蛋白能否为单体或多聚体②双向对角线SDS-PAGE：既无链内又无链间二硫键的分子位于对角线上(两向电泳中分子迁移率相等) ;存在链内二硫键的分子位于对角线的上方(第一向泳动快,第二向泳动慢) ;而存在链间二硫键的分子由于第二向电泳时被复原,分子变成小的肽链而位于对角线的下方〔〔〔〔6 6〕二硫键分析〕二硫键分析〕二硫键分析〕二硫键分析①单向SDS-PAGE：存在链内二硫键的分子在非复原的SDS-PAGE 中没有完全伸展,构造更严密而较在复原的SDS-PAGE 中泳动快;存在链间二硫键的分子在复原的SDS-PAGE 中被复原,分子变为小的肽链而较在非复原的SDS-PAGE 中泳动快〔〔7〕重组蛋白构造分析〕重组蛋白构造分析①二级构造分析：常用圆二色性，测定二级构造中α-螺旋、转角、β-折叠及无规卷曲的含量，并与天然蛋白的二级构造进展比较。

②高级构造分析：X-射线衍射及核磁共振 2002年度的诺贝尔化学奖获得者之一维特里希〔Kurt Wüthrich〕〔瑞士苏黎士联邦理工学院〕教授的奉献是把核磁共振〔NMR〕分析方法运用到了生物大分子(蛋白质和核酸)的构造研讨中，建立了一套完好确实定生物大分子空间构造的方法2.纯度分析纯度分析〔1〕目的蛋白质含量测定：常用方法有复原或非复原SDS-PAGE法、HPLC、毛细管电泳等〔2〕杂质：包括蛋白和非蛋白杂质①①蛋白类杂质：包括宿主细胞蛋白和目的蛋白本身由于降解、蛋白类杂质：包括宿主细胞蛋白和目的蛋白本身由于降解、聚合、错误折叠而呵斥的蛋白变构体这些变构体容易抗体聚合、错误折叠而呵斥的蛋白变构体这些变构体容易抗体的产生，需求严厉控制的产生，需求严厉控制②非蛋白类杂质：包括病毒、细菌、热原、内毒素、致敏原、DNA等3.生物活性测定：需求经过动物体内实验和细胞培育进展体外测定此外，需求测定重组蛋白的抗原性，防止其过强的免疫原性诱发体内产生免疫反响呵斥损伤还有长期毒性实验体内测定：建立适宜的动物模型体外测定：细胞培育计数法、3H-T α R掺入法等4.稳定性调查：防止其在贮藏过程中的脱氨、氧化、磺酰化、聚合或降解等呵斥的分子变化。

5.产品一致性的保证1.液态保管①低温保管②在稳定pH下保管③高浓度保管：浓度高，蛋白质比较稳定④加维护剂保管：多数蛋白质在疏水环境下稳定，可参与稳定剂如糖类、脂肪类、蛋白质类、多元醇、有机溶剂；有些蛋白质在高离子强度下稳定，可参与中性盐；有些蛋白质易氧化，可参与一些复原剂五、产品的保管五、产品的保管2.固态保管：制成干粉或结晶，在枯燥器中4度可长期保管第十节第十节  基因工程药物的制造流程基因工程药物的制造流程质量控制规范和要求：质量控制规范和要求：〔1〕干扰素效价测定〔2〕蛋白质含量测定：福林-酚法〔3〕比活性：干扰素效价的国际单位与蛋白质质量的毫克数之比〔4〕纯度测定：非复原型SDS-PAGE,银染为单一条带，扫描仪测定纯度>95%；HPLC测定呈一个吸收峰，或主峰占峰总面积的95%以上〔5〕相对分子量测定：复原型SDS-PAGE法，与规范蛋白质MARKER比较，与实际值误差不得大于10%〔6〕剩余外源性DNA测定：探针杂交，应低于100pg〔7〕剩余血清IgG含量测定〔8〕剩余抗生素活性测定〔9〕紫外光谱扫描：最大吸收峰应为280+2nm〔10〕肽图测定：用CNBr裂解法〔12〕等电点测定：用等电聚焦法废品检定废品检定〔1〕物理外形：冻干制品为白色或为黄色疏松体，加水后不含有肉眼可见的不溶物。

〔2〕鉴别实验：ELISA法〔3〕水分测定〔4〕无菌实验〔5〕热原实验〔6〕干扰素效价测定〔7〕平安实验：豚鼠腹侧皮下注射剂量为人每千克体重临床运用最大量的3倍，察看7天，部分无红肿、坏死、总体重不下降即为合格；5只小鼠尾静脉注射剂量为人3倍药物，察看7天，假设动物全部存活为合格。