蛋白质纯化仪的使用 (1).doc

1蛋 白 质 纯 化 仪 使 用 说 明1.认识机器本机器最适常规流程图：使用机器前所有端口请按如图所示连接，将“A 泵溶液进口线”“B 泵溶液进口线”放进超纯水中按如图所示先不要连接柱子建议一般使用 A 泵进液，如需梯度洗脱时才用 B 泵除上样样品（14000 rpm/12000 rpm 离心 30min）外，所有在此机器上要用的溶液必须要经过 0.22 μm 滤膜过滤样品泵A 泵 B 泵多波长检测器pH 计混合池层析柱切换阀进样环溶液由 A/B 泵进入仪器进样阀层析柱切换阀多波长检测处自动收集器废液出口A 泵溶液进口线 B 泵溶液进口线整合电导检测器22.开机打开计算机、蛋白质纯化仪（电源在右侧下角） 、自动收集器（电源在后面右侧） 此时蛋白质纯化仪上部分指示灯会亮，有黄色的、有蓝色的，开机较慢，请稍等，当蛋白质纯化仪上所有指示灯不亮时，才可进行操作3.启动电脑“ChromLab”软件双击电脑“ChromLab”应用程序，进入如下界面：4.洗泵单击“Manual Run”进入：我们主要看右下方这块（图中所示模块均可双击设置参数）：双击“样品泵”模块出现如图所示对话框：3双击“层析柱切换阀”模块如下图所示：此步骤主要是洗泵工作，请确保层析柱不再在洗脱程序中，点击“Bypass”点击此处可让可更改溶液的流动方向。

点击 1-5 可设置连接不同的层析柱端口设置流速设置压力，小于选择的柱子承受最大压力在下面“控制流速以防止超压”前面打对勾，以保护柱子不特殊设置，默认 A 泵工作此处可控制机器的运行与停止4双击“样品泵”模块出现如下图所示：选择“System Pump Waste”模式后，轻按仪器上“A 泵”的“Purge”按钮，稍等片刻，即将进行 A 泵的洗泵工作，此时流速将会达到最大 10 mL/min如果想洗 B 泵（凝胶过滤时不需要） ，轻按仪器上“B 泵”的“Purge”按钮即可注意此时废液将从“样品泵”模块上的“Waste 2”出口处留出，拿好废液缸目的：洗 A、 B 泵 目的：Loop 环上样5A、B 泵洗完后，选择“Manual Load Loop”点击“Start ”让超纯水在机身内流动片刻，此时废液将从自动收集器那边的废液口流出点击“Stop”再选择 “System Pump Inject Loop”此时再开始，将冲洗样品环最后停止将 A、B 泵溶液进口线分别放入后续实验需要用的缓冲液中，重复以上过程嗯，洗完泵以后，把 A 泵溶液进口线放入超纯水中65.Developing a Method单击“New Method”进入如下界面：首先，我们先选择合适模块运行程序，如 1 中的流程图所示是最佳选择：如图所示是 Ni-Affinity 1mL 柱体积的最佳模式：选择运行模块按钮选择柱子类型选择柱子型号柱子体积柱子所承受最大压力选择柱子连接端口处自动收集器板块，目前实验室自只能选择这个控制程序默认流速处，一定要勾选第一个，防止操作不当导致压力过大，对柱子造成损伤。

第二个不必选中，本机器没有购买空气检测器此处勾选，pH 计才正常工作设置波长检测处可设置按柱体积（CV）走溶液的用量，还是按 ml 数走溶液用量2607如图所示是 Gel-filtration ENrichTM SEC 650 的最佳模式：当创建好上述内容后，我们就开始设置具体的步骤，一般来说一个纯化过程以下步骤是不可少的，如图：（此时可以点击左侧需要步骤按住不放，拖到右侧即可创建，添加洗脱步骤时一般选择“Colum Wash”创建）把鼠标放在右侧过程图中，单击右键可修改步骤名称下图流程仅供参考柱平衡平衡进样洗脱样品洗柱8Ni-Affinity 模式 Gel-filtration 模式：可根据情况适当调整下一步就是设置每一步的流速和溶液用量了（点击你所要设置的步骤，在右侧就会出现相应的设置条件）：例如，水洗、挂 Ni2+、柱平衡、不同浓度咪唑洗脱、EDTA 洗脱、20% 乙醇冲柱等过程设置如图：20 % ethanol水洗20 % 乙醇此处设置流速，打钩为默认流速，可不勾选，设置自需流速单一溶液洗脱时，双击此按钮，当 B 溶液为100%时，说明溶液全部从 B 泵进入。

为 0 时，溶液均从 A 泵进当设置梯度洗脱时双击此按钮连续梯度洗脱，不设 B 溶液的百分比，只设置洗脱溶液体积即可；阶段性梯度洗脱，需设置 B 溶液的百分比和洗脱体积例图所示代表含义为：50%的 A 溶液和50%的 B 溶液混合后洗脱，洗脱体积为10 个柱体勾选此处可设置，自动收集全部收集 设置收集体积，图例为 0.2 mL 每管单击此处，可设置按波峰收集一般不建议用除非已对所纯化蛋白出峰位置非常了解9样品进样设置如下：按如上过程设置好自己需要的流程后，即可开始程序：点击上方第二行的“Star Run”→“OK”即可运行以后会出现如下图画面，等待机器运行：设置进样环体积 1ml/5ml首先单击这里选择进样环进样设置流速，建议不要太快，影响挂柱效率 设置进样环体积 1ml/5ml10程序运行以后，先不要急着休息，点击下图左上角的“Hold Step”，此时连接柱子将“层析柱交换阀”上相互连接的两根线从中间拧开，接柱子注意：1.注意柱身上标示的溶液流动方向（上端→下端） 2.旋开柱子顶端和下端的螺母，让纯化仪的出水端先连接柱子的下端，让水从柱子的上端流出，待柱子上端有水滴停留时，将纯化仪的出水端接到柱子的上端，此时在再连接柱子的下端。

目的：防止有气泡进入柱子内3.如果用凝胶过滤柱时，除了要特别注意防止气泡进入，还要，注意的摆放姿势一定要保持垂直，否则会影响纯化的效率4.顺便说一下，柱子使用完毕后，应在保持液体流动的情况下，先拆卸柱子的下端，再拆卸柱子的上端，防止柱内保护液体的损失4℃保存柱子安装完毕后，在“Hold Step”点击“Resume”开始运行你预先设置好的程序嗯，当然，咱们的机器也不是全自动的，开头和结尾还是需要11动身换一下相应的溶液的1.记好是 A 泵还是 B 泵进液2.换溶液时，注意将仪器暂停以后再操作，手不要抖，动作尽可能的慢一点3.换溶液时，还要注意看看溶液进口处有没有空气进入，有的话，可以用注射器加点液体到细管内好了，那就可以安心的让它运行了记得柱平衡步骤时，调零此时如果无聊的话，你就可以将样品倒吸入样品环了，反正早晚也要弄顺便把注射器、进样针、Loop 环和自制的出液口细管（连接在样品泵“Waste 2”的出口上）再用缓冲液多洗两遍以防止污染注意你的样品要提前在 14000 rpm（最好，还可冷冻离心）/12000 rpm 离心 30 min，重新将上清转移到新的离心管中，以确保样品中不含微小颗粒，防止阻塞仪器和柱子。

上样技巧：1.确定你的样品量：以 1 mL 进样环为例，最好样品体积为 800-900 μl 最佳，此时倒吸一定不要将所有样品人为引入气泡吸进去，确保留一点点2.然后用 200-100 μl 的蛋白缓冲涮洗离心管 1 mL 你懂得，千万不能超3.加样后，进样针就不可以离开进样孔了，否则样品将会从被吸上来的地方流出去冲洗离心管时让它留在那就行了4.倒吸涮洗离心管的溶液时，可将溶液都吸完，还可以稍微多吸那么一点点，但也仅仅那么一点点，为了是不让样品浪费，你要保证空气不能进入进样环哦~。