第二十章比色法和分光光度法chapter20479101053.ppt

第二十章 比色法和分光光度法20.1 概述20.2 光吸收定律20.3 比色法和分光光度法及其仪器20.4 显色反应与显色条件的选择20.5 分光光度法仪器测量误差及消除20.6 分光光度法的应用20.7 荧光分光光度法20.1 概述概述20.1.1 分（吸）光光度法及其特点分（吸）光光度法及其特点比色法：利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度目视比色法：用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅分光光度法：用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度分光光度法的特点：Ø灵敏度高10-3 －10-6 mol/LØ准确度高相对误差2－5％Ø仪器设备简单、操作简便Ø应用范围广20.1.2 吸收光谱吸收光谱1.光谱区的划分光谱区的划分微波远红外近红外可见光近紫外真空紫外X-射线-射线波长1000um10um100nm10nm红 620 － 750nm橙 590 － 620nm黄 570 － 590nm绿 550 － 570nm青 495 － 550nm蓝 450 － 495nm紫 380 － 450nm190－400nm2. 可见光吸收光谱可见光吸收光谱光的互补色示意图光的互补色示意图白光红红橙橙黄黄绿绿青青青蓝青蓝蓝蓝紫紫Ø单色光：单一波长光Ø复合光：复合波长光Ø互补光：处于同一直线上的两种光。

Ø互补光按一定强度比例混合，即得白光Ø溶液颜色：互补光的颜色吸光度吸光度：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶液后，被吸收的光的比例吸收光谱曲线吸收光谱曲线：溶液对不同波长光的吸收强度，即以入射光波长为横坐标，吸光度为纵坐标所做的一条曲线最大吸收波长最大吸收波长：物质对该波长的光吸收最大，即吸收光谱曲线上的最大峰值3. 吸收光谱曲线吸收光谱曲线透过率透过率：某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶液后，没有被吸收的光（即透过的光）的比例四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图1-洋川芎内酯H；2-洋川芎内酯I；3-瑟丹酸内酯；4-藁本内酯l 物质分子的运动状态物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转；原子在平衡位置的振动； 分子自身的转动l 分子的能量分子的能量 价电子能级的能量＋振动能级的能量＋转动能级的能量l 能级差与对应的光谱能级差与对应的光谱 价电子能级间能量差1-20eV，紫外-可见光的能量； 振动能级间能量差0.05-1eV，红外光的能量； 转动能级间能量差10-4-0.05eV，远红外光及微波的能量。

4. 物质吸收光的本质物质吸收光的本质l 吸收光谱与发射光谱吸收光谱与发射光谱 分子吸收能量后受到激发，分子就从基态能级跃迁到激发态能级，因而产生吸收光谱 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态，就会以光子的形式释放能量，从而产生发射光谱l 紫外紫外-可见吸收光谱可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光（紫外-可见光）后，从基态跃迁到激发态20.2 光吸收定律光吸收定律Ø朗伯（朗伯（Lambert）定律）定律：：一束单色光通过吸光物质的溶液后，光吸收程度（吸光度）与溶液液层厚度液层厚度成正比A为吸光度; I0为入射光强I为透过光强; T为透光度k’为比例常数b为液层厚度（光程长度）bI0 I即：Ø 比耳（比耳（Beer）定律）定律：： 一束单色光通过吸光物质的溶液后，光的吸收程度与吸光物质微粒（分子）的数目（浓度浓度c）成正比即：Ø 朗伯朗伯-比耳定律：比耳定律： 当b单位为cm，c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸光系数，其单位为cm-1mol-1L 的大小与吸光物质的性质、入射波长和温度有关朗伯-比耳定律的适用范围：Ø不仅适用于溶液，也适用于均匀的气态吸光物质和固态吸光物质；Ø它是各种吸光光度法定量分析的依据。

思考：摩尔吸光系数如何测定？工作曲线（标准曲线）工作曲线（标准曲线）：测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线要求这一曲线为直线，即测定信号与被测物浓度成正比Ø理想情况下工作曲线过原点；Ø直线的线性范围是有限的（高浓度端偏离）；通常要求两个数量级以上的线性范围；Ø样品中被测物浓度应在工作曲线的线性范围内偏离比耳定律：偏离比耳定律：即工作曲线在高浓度端发生偏离偏离比耳定律的原因：偏离比耳定律的原因：l比尔定律本身的局限性比尔定律本身的局限性比尔定律假设了吸光分子之间无相互作用，事实上，高浓度时分子间相互作用不可忽略l入射光为非单色光时的偏离入射光为非单色光时的偏离仪器的分光元件（单色器）很难得到真正的单色光，而是波长范围很窄的复合光带，而比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的l化学因素引起的偏离化学因素引起的偏离其一是介质不均匀（胶体、乳浊液、悬浮液）而产生折射、散射和反射，使透过光强减弱（A增大）其二是吸光分子发生化学变化而改变浓度20.3 比色法和分光光度法及其仪器比色法和分光光度法及其仪器1. 光度分析方法光度分析方法Ø目视比色法：Ø光电比色法：用光电比色计测定未知溶液和标准溶液的吸光度。

光电比色计用光电比色计用滤光片滤光片得到得到较窄波长范围的入射光较窄波长范围的入射光；；Ø分（吸）光光度法：用分光光度计测定未知溶液和标准溶液的吸光度 分光光度计用分光光度计用棱镜棱镜或或光栅光栅做分光元件得到做分光元件得到单色入射光单色入射光2. 分光光度计的基本部件分光光度计的基本部件光源单色器吸收池检测系统结果显示光源：光源：Ø 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯，波长范围320-2500nm；Ø 在紫外区使用氢灯或氘灯，波长范围180-375nmØ 使用稳压器保证光强稳定单色器：单色器：Ø色散元件：将连续光谱分解为单色光的元件（如棱镜、光栅）；Ø单色器：由入射狭缝、准直透镜、色散元件、聚焦透镜和出射狭缝构成Ø玻璃吸收紫外光，所以玻璃棱镜仅用于350-3200nm波长范围，只能用于可见分光光度计；石英（ 185-4000nm ）则可用于整个紫外-可见光区Ø光栅利用光的衍射与干涉作用，其优点是适用波长范围宽、色散均匀、分辨率高；但其缺点是各级光谱有重叠而产生相互干扰吸收池（比色池、比色皿）：吸收池（比色池、比色皿）：Ø用无色透明、耐腐蚀的光学玻璃或石英制造Ø因玻璃吸收紫外光，所以玻璃吸收池只能用于可见光区。

Ø杯差：一对比色池对光吸收的差异，实验前要先校杯差检测系统检测系统： 光电转换元件（硒光电池、光电二极管）结果显示部分：结果显示部分： 直接显示出测定结果的数值（吸光度、透过率等）20.4 显色反应与显色条件的选择显色反应与显色条件的选择显色反应显色反应：将无色或吸光系数很小的被测物与显色剂显色剂反应，使之转变成具有较强UV或Vis吸收的化合物后测定显色剂：显色剂：能与被测物反应，并使之显（颜）色的试剂Ø无机显色剂（硫氰酸盐、鉬酸铵、双氧水等）与被测物生成的有色物的稳定性、灵敏度和选择性都不高，应用较少Ø有机显色剂（磺基水杨酸、二苯硫腙等）大多能与金属离子形成稳定的有色配（螯）合物生色基团举例：生色基团举例：碳碳三键：max=175nm， 跃迁；碳碳双键：max=190nm， 跃迁；苯： max=254，250，204nm， 跃迁；羧基：max=204nm， n跃迁；生色基团：生色基团：分子吸收紫外-可见光与其分子结构有关；紫外-可见吸收光谱涉及的电子跃迁是： n（非键轨道）， n和对显色反应的要求：对显色反应的要求：Ø具有较高的灵敏度。

摩尔吸光系数103－105；Ø有较好的选择性；Ø生成的显色物（多为螯合物）稳定、组成恒定；Ø产物颜色应与被测物颜色有较大差异；Ø显色条件应易于控制萃取光度法：萃取光度法： 当显色剂与被测物（通常是金属离子）生成的有色物在有机溶剂中有很好的溶解度时，可以让水相中生成的有色物萃取到有机相，用有机相进行光度分析显色条件的选择：显色条件的选择：l显色剂的用量显色剂的用量l酸度酸度酸度可能会影响显色剂浓度、显色剂颜色、配合物组成和被测离子存在状态l显色温度显色温度l显色时间显色时间l溶剂种类溶剂种类很多显色配合物只在有机溶剂中稳定l干扰的避免与消除干扰的避免与消除20.5 分光光度法仪器测量误差及消除分光光度法仪器测量误差及消除测定波长的选择：Ø一般情况下选择显色配合物的最大吸收波长；Ø为避免干扰，有时也选择干扰小的非最大吸收波长比色池的选择：Ø 通常使用1cm比色池；Ø 根据样品浓度和显色配合物的灵敏度高低，可以选用其他厚度的比色池Ø目的是消除池壁、溶剂、反应试剂等对入射光的反射和吸收所带来的系统误差系统误差；Ø只有被测产物有吸收，其他反应试剂均无吸收时，可用纯溶剂做参比；Ø显色剂或其他试剂有颜色时，用试剂空白做参比；Ø如果干扰物质也生成类似显色产物，也可按下法制备一个参比溶液：在显色之前先将被测物掩蔽起来，只让干扰物质显色，该空白溶液做参比便可消除干扰。

参比溶液的选择：参比溶液的选择：20.6 分光光度法的应用分光光度法的应用1. 应用范围应用范围Ø既直接用于有色物测定，也通过显色用于无色物分析；Ø既用于常量分析（>1%），也用于微量分析（0.01-1%）;Ø既用于无机离子分析，也用于有机物分析；Ø既用于定量分析，也可用于定性分析（特征吸收光谱、功能基团特征吸收峰）；Ø可用于其他领域的研究（如化学平衡）；Ø目前环境等领域的很多标准分析方法仍然采用光度法2. 单组分测定单组分测定Ø通常在最大吸收波长下测定吸光度，采用标准曲线法定量3. 多组分的测定多组分的测定Ø吸收光谱不重叠时，可在各自的最大吸收波长下分别测定Ø吸收光谱单向重叠，即组分1干扰组分2，而组分2不干扰组分1的测定，这时只能直接测定组分1含量，要测定组分2含量，必须先用组分1的标准溶液测定出组分1在组分2的测定波长下的摩尔吸光系数，并用已测定出的组分1的浓度，计算波长2下组分1的吸光度，并从波长2下组分1和2的总吸光度中扣除组分1的吸光度Ø吸光度双向重叠需解联立方程3. 差示分光光度法差示分光光度法Ø分光光度法测定时，吸光度读数通常要求在0.2-0.8范围内，误差最小是A=0.434。

Ø当测定浓度比较大的样品时，由于吸光度读数超出准确读数的范围，会产生很大影响差示分光光度法：差示分光光度法：用比样品浓度略低的标准溶液作参比代替一般情况下的试剂空白参比，使测定吸光度数值在0.2-0.8范围内4. 配合物组成的测定配合物组成的测定摩尔比法摩尔比法：固定金属离子浓度[M]，改变配体浓度[L]，在小于配合物组成比时，随着[L]/[M]比值的最大，形成的配合物浓度最大，溶液的吸光度增加，达到配合物组成比之后，再增加[L]，即增加[L]/[M]比值，形成的配合物浓度已基本变，从吸光度A与[L]/[M]的关系曲线即可求得配合物的摩尔组成比A[L]/[M]12120.7 荧光分光光度法荧光分光光度法光致发光现象光致发光现象：某些物质分子受到电磁辐射照射时，能发射出相同波长和更长波长的光荧光是光致发光的一种荧光现象荧光现象：物质吸收波长较短的光后，发出波长较长的光可见（分子）荧光可见（分子）荧光：物质吸收波长较短的紫外光后，发出波长较长的可见荧光荧光分析法（荧光分光光度法）荧光分析法（荧光分光光度法）：利用分子荧光现象，测定荧光强度，从而测定荧光物质或非荧光物质（衍生化）荧光分析法原理荧光分析法原理Ø分子吸收光而被激发，使电子从基态上升至激发态，处于某一振动状态；Ø分子碰撞而失去振动能量，急剧降低至激发态中的最低振动能级；Ø电子从激发态中的最低振动能级；跃迁回基态的各振动能级，并以光的形式释放能量，此光即为荧光。

基态激发态无辐射跃迁荧光发射光谱荧光光谱能级跃迁图能级吸收振动能级荧光分析法的特点：荧光分析法的特点：Ø灵敏度高灵敏度高比UV-Vis高约3个数量级Ø选择性好选择性好首先能发生荧光的物质少，且发生荧光的物质还必须吸收一定频率的光（激发），即使不同物质都吸收了特定频率的光，不同物质发出的荧光波长也不一定相同Ø方法简便、快速简便、快速Ø应用范围窄应用范围窄这是因为能产生荧光的物质很有限实例实例1：荧光分析法测定邻- 与间-羟基苯甲酸Ø邻- 与间-羟基苯甲酸均含有能发射荧光的苯环，但取代基的位置不同使它们具有不同的荧光性质；Ø碱性溶液中（pH12），二者在310nm附近紫外光的激发下均发生荧光，而在中性偏酸性溶液中（pH5.5）只有邻-羟基苯甲酸发荧光；对-羟基苯甲酸在上述两种条件下均不发生荧光，故不干扰测定Ø对于一个可能含有邻- 、间-和对-羟基苯甲酸的样品溶液，先在pH5.5测定邻-羟基苯甲酸含量，然后在pH12测定邻- 与间-羟基苯甲酸总量，计算得到间-羟基苯甲酸含量实例实例2：环糊精增敏4-羟基香豆素衍生荧光法测定肉制品中痕量亚硝酸盐Ø在酸性溶液中，NO2-能与过量4-羟基香豆素形成低荧光低荧光衍生物—3-亚硝基- 4-羟基香豆素，该产物经Na2S2O3还原为3-氨基- 4-羟基香豆素，此还原产物在碱性条件下发射较强荧光较强荧光。

如果有-环糊精存在，由于-环糊精对发光体的包络作用，使荧光强度大大增强Ø激发波长332nm，发射波长457nmØ线性范围：1-1200ng NaNO2/25mL检测下限：40pg/mL作作 业业 p326: 2, 4, 7, 10p333-334: 1，，3，，5p392p392：：1 1p393p393：：4 4，，6 6p393：10，，12p394：18, 20, 25p413: p413: 3, 63, 6。