第一节工业生产常用的微生物工业生产常用的微生物从ppt课件.ppt

第一节 工业消费常用的微生物一、工业消费常用的微生物* · 从自然界中分别出来就能被利用； · 对野生菌株进展人工诱变，得到突变株才干被利用 · 运用重组DNA技术改造的菌株目前育种总趋势 从野生菌转向变异菌 自然选育转向代谢育种 从诱发基因突变转向基因重组的定向育种第二章 生物工业菌种与种子的扩展培育 由于发酵工程本身的开展以及遗传工程的介入，藻类〔alga〕、病毒〔virus〕等也正在逐渐地变为工业消费用的生物 虽然如此，目前人们对微生物的认识还是非常不够的曾经初步研讨的不超越自然界微生物总量的10%左右 微生物的代谢产物据统计已超越一千三百多种，而大规模消费的不超越一百多种； 微生物酶有近千种，而在工业上利用的不过四五十种可见潜力是很大的 在工业消费中常用的微生物主要有细菌、酵母菌、霉菌和放线菌 工工业消消费常用的常用的细菌有菌有 枯草芽枯草芽孢杆菌杆菌(Bacillus subtilis) 乳酸杆菌乳酸杆菌(Lactobacillus lactics) 醋酸杆菌醋酸杆菌(Acetobacter) 棒状杆菌棒状杆菌(Corynebacterium) 短杆菌短杆菌(Brevibacterium) 用于消用于消费：： 消消费淀粉淀粉酶(amylase〕〕 蛋白蛋白酶〔〔proteinase〕〕 乳酸乳酸(lactic acid) 醋酸醋酸(acetic acid) 氨基酸氨基酸(amino acid) 肌苷酸肌苷酸(inosinic acid)  细菌〔bacteria〕： 属于单细胞原核生物〔 unicellular prokaryote〕，以典型的二分分裂(binary)方式繁衍。

细胞生长时，环状染色体〔chromosome〕被复制，细胞内的蛋白质等组分同时添加一倍，然后在细胞中部产生一横段间隔，染色体被分开，继而间隔分裂构成两个一样的子细胞 如间隔不完全分裂就构成链状细胞  酵母菌〔yeast〕 酵母菌为单细胞真核生物〔 unicellular eukaryote〕，在自然界 中普遍存在，主要分布于含糖质较多的的酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜〔nectar〕和植物叶子上，以及果园土壤中石油酵母〔petroleum yeast〕较多地分布在油田周围的土壤中 酵母菌大多为腐生，常以单个细胞存在，以发芽方式进展繁衍母细胞体积长到一定程度时就开场发芽芽长大的同时母细胞减少，在母子细胞间构成隔膜，最后构成同样大小的两个细胞假设子芽不与母细胞脱离就构成链状细胞，称为假菌丝(pseudomycelium) 工业上用的酵母菌有：啤酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)、假丝酵母(Candida)、类酵母(Saccharomycodes)等，用于酿酒(Brewing)、制造面包、制造低凝固点石油、消费脂肪酶〔lipase〕，以及消费可食用、药用和饲料用酵母菌体蛋白等。

真真核核细胞胞构构造造表表示示图  霉菌〔mould〕 霉菌不是一个分类学上的名词凡生长在营养基质上构成绒毛状、网状或絮状菌丝的真菌(fungi)统称为霉菌 霉菌在自然界分布很广，大量存在于土壤、空气、水和生物体内外等处它喜欢偏酸性环境，大多数为好氧性(aerobiotic)，多腐生，少数寄生霉菌的繁衍才干很强，它以无性孢子和有性孢子进展繁衍，大多以无性孢子繁衍为主 生长方式是菌丝末端的伸长和顶端分支，彼此交错呈网状菌丝的长度即受遗传性的控制，又受环境的影响，其分支数量取决于环境条件菌丝或呈分散生长，或呈菌丝团状生长 工业上常用的霉菌有： 藻状菌纲的根霉、毛霉、犁头霉，子囊菌纲的红曲霉，半知菌类的曲霉、青霉等； 产品： 酶制剂〔enzyme preparation〕、抗生素(antibiotic)、有机酸〔organic acid〕及甾体激素〔steroid hormone〕 等  放放线菌菌(Actinomycetes) 放放线菌因菌落呈放菌因菌落呈放线状而得名。

它是一个原核生物状而得名它是一个原核生物类群，在自然界中分布很广，尤其在含有机群，在自然界中分布很广，尤其在含有机质丰富的微碱性丰富的微碱性土壤中土壤中较广大多腐生，少数寄生大多腐生，少数寄生 放放线菌主要以无性菌主要以无性孢子子进展繁衍，也可借菌展繁衍，也可借菌丝片段片段进展繁衍后一种繁衍方式展繁衍后一种繁衍方式见于液体沉没培育〔于液体沉没培育〔submerged cultures〕中其生〕中其生长方式是菌方式是菌丝末端伸末端伸长和分支，彼此和分支，彼此交交错成网状构造，成成网状构造，成为菌菌丝体菌丝长度即受度即受遗传性的控性的控制，又与制，又与环境相关  在液体沉没培育中由于搅拌器〔agitator〕的剪应力作用，经常构成短的分支旺盛的菌丝体，或呈分散生长，或呈菌丝团状生长它的最大经济价值在于能产生多种抗生素〔antibiotics〕从微生物中发现的抗生素，有60%以上是放线菌产生的，如链霉素、红霉素、金霉素、庆大霉素等 常用的放线菌主要来自以下几个属：链霉菌属、小单孢菌属和诺卡氏菌属等  其他生物： 　 A: 担子菌〔Basidiomycetes 〕：所谓的担子菌就是人们通常所说的菇类(mushroom)生物。

担子菌资源的利用正愈来愈引起人们的注重，如多糖(polysaccharide)、抗癌(anticancer)药物的开发　 近几年来，日本、美国的一些科学家对香菇的抗癌作用进展了深化的研讨，发现香菇中的“1，2-β-葡萄糖苷酶〞及两种糖类物质具有抗癌作用  B：病毒：病毒(virus) 其特点如下：其特点如下： 　　 1. 形体微小，体形体微小，体积比比细菌菌小的多 2. 没有没有细胞构造，是一种胞构造，是一种独特分子的生物，主要由核独特分子的生物，主要由核酸和蛋白酸和蛋白质构成 3. 营寄生生活，由于缺乏寄生生活，由于缺乏独立代独立代谢的的酶体系，不能脱体系，不能脱离寄主而自行生离寄主而自行生长繁衍，有繁衍，有专注性 　　　　人类免疫缺陷病毒 〔 human immunodeficiency virus ，HIV 〕获得性免疫缺陷综合症〔 acquired immunodeficiency syndrome， AIDS 〕 噬菌体〔phage〕是病毒的一种 Ｑ：烈性噬菌体和温暖噬菌体概念与区别。

噬菌体在寄主细胞中的生长繁衍过程可分为吸附、浸入、增殖、成熟和释放　 C：藻：藻类〔〔alga〕：〕： 培育螺旋藻，按干重培育螺旋藻，按干重计算每公算每公顷可收可收获60吨，而种植吨，而种植大豆每公大豆每公顷才可才可获4吨；从蛋白吨；从蛋白质产率来看，螺旋藻是大率来看，螺旋藻是大豆豆28倍 培育珊列藻，从蛋白培育珊列藻，从蛋白质产率率计算，每公算，每公顷珊列藻所得珊列藻所得蛋白蛋白质是小麦的是小麦的20-35倍此外，倍此外，还可可经过藻藻类将将CO２２转变为石油，培育石油，培育单胞藻或其他藻胞藻或其他藻类而而获得的石油，可占得的石油，可占细胞干重得胞干重得5%-50%,合成的油与重油一合成的油与重油一样，加工后可，加工后可转变汽汽油、煤油、和其他油、煤油、和其他产品 有的国家已建立培植有的国家已建立培植单胞藻的胞藻的农场，每年每公，每年每公顷地培地培植的植的单胞藻按胞藻按5%干物干物质为碳水化合物〔石油〕碳水化合物〔石油〕计算，可算，可得得60吨石油燃料此吨石油燃料此项技技术的运用，的运用，还可减可减轻因工因工业消消费而大量排放而大量排放CO２呵斥的温室效２呵斥的温室效应。

国外国外还有人从有人从“藻藻类农场〞〞获取取氢能的能的报道，大量培道，大量培育藻育藻类，利用其光合放，利用其光合放氢作用来作用来获得得氢能藻藻 类类 工工 厂厂 　　　二、 微生物工业对菌种的要求 目前，随着微生物工业原料的转换和新产品的不断出现，势必要求开辟更多新种类虽然微生物工业用的菌种多种多样，但作为大规模消费，对菌种那么有以下要求： (1)　廉价原料、生长迅速、目的产物产量高 (2)　易于控制培育条件，酶活性高；发酵周期较短 (3)　抗杂菌和嗜菌体的才干强 (4) 菌种纯，不易变异和退化，不产生任何有害的生物活性物质和毒素，保证平安消费  在挑选所需的菌种时应思索的一些重要的目的： 　 〔1〕 菌种的营养特征： 　　〔2〕 菌种的生长温度： 　　〔3〕 菌种对所采用的设备及消费过程的顺应性： 　　〔4〕 菌种的稳定性： 　　〔5〕 产物的得率和产物的浓度： 　 〔6〕 产物容易回收： 能满足〔3〕~〔6〕，那么有希望成为效益较高的消费菌种。

第二节第二节 菌种的衰退、复壮与保藏菌种的衰退、复壮与保藏 一、微生物菌种衰退的缘由一、微生物菌种衰退的缘由 1. 缘由缘由 一是菌种保藏不妥一是菌种保藏不妥; 二是菌种生长的要求没有得到满足，或二是菌种生长的要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需求的条是遇到不利的条件，或是失去某些需求的条件；件； 三是经诱变获得的新菌株发生回复突变，三是经诱变获得的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征的情况从而丧失新的特征的情况 延续传代是菌种退化的直接缘由，这是延续传代是菌种退化的直接缘由，这是由于菌种经常处于旺盛的生长形状由于菌种经常处于旺盛的生长形状 衰退菌株的特点：个体或群体特征发生衰退菌株的特点：个体或群体特征发生变化；消费才干降低；代谢才干降低；发酵变化；消费才干降低；代谢才干降低；发酵周期延伸；抗不良环境才干降低周期延伸；抗不良环境才干降低　　　　 2 防止菌种衰退的措施 菌种的分别菌种的分别: 由于在菌种发生衰退的由于在菌种发生衰退的同时，并不是一切的菌体都衰退，其中未同时，并不是一切的菌体都衰退，其中未衰退的菌体往往是经过环境条件考验的，衰退的菌体往往是经过环境条件考验的，具有更强的消费才干。

具有更强的消费才干 因此，对于已衰退的菌株采用单细胞因此，对于已衰退的菌株采用单细胞菌株分别的措施，即用稀释平板法或用平菌株分别的措施，即用稀释平板法或用平板划线法，以获得单细胞所长成的菌落〔板划线法，以获得单细胞所长成的菌落〔colony〕，再经过菌落和菌体的特征分析〕，再经过菌落和菌体的特征分析和性能测定，就可获得具有原来外形的菌和性能测定，就可获得具有原来外形的菌株，甚至性能更好的菌株〔株，甚至性能更好的菌株〔strain〕 假设菌种曾经发生退化，产量下降，那么要进 行分别复壮 如对芽孢杆菌(Bacillus)，可先将菌液用沸水处置几分钟，再用平板进展分别，从所剩下的孢子中挑选出最优的菌体 假设遇到某些菌株即使进展单细胞分别，仍不能到达复壮的效果，那么可改动培育条件，到达复壮的目的 如AT3.942栖土曲霉(Aspergillus terricola)的产孢子才干下降，可适当提高培育温度，恢复其才干 同时经过实验选择一种有利于高产菌株而不利于低产菌株的培育条件。

 其它防其它防 衰衰 措措 施施菌种的复壮菌种的复壮提供良好的环境条件提供良好的环境条件运用优良的保管方法运用优良的保管方法定期纯化菌种定期纯化菌种二 、 菌种的复壮n经过分别到达复壮:菌落纯/细胞纯n 在琼脂平板划线、涂布或与琼脂培育基混合培育再分别，到达—菌落纯 n 采用单细胞或单孢子分别法到达—细胞纯n经过寄主体到达复壮: n 对于寄生性微生物的退化菌株,将菌株接种到寄主细胞进展繁衍到达复壮 三、菌种保藏〔strain preservation〕 根本原理：根据菌种的生理、生化特点，人为地发明根本原理：根据菌种的生理、生化特点，人为地发明条件，使菌种的代谢活动处于休眠形状条件，使菌种的代谢活动处于休眠形状 要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌要求：维持菌种的存活和减少菌种的变异，尽量使菌种坚持原来优良的消费性能。

种坚持原来优良的消费性能 保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如保藏时首先选择优良纯菌种，最好是它们的休眠体如孢子〔孢子〔 spore〕、芽孢〕、芽孢 (gemma)等；其次是要发明一个有等；其次是要发明一个有利于休眠的环境条件，如低温、枯燥、缺氧和缺乏营养利于休眠的环境条件，如低温、枯燥、缺氧和缺乏营养物质等，使菌体的代谢活动处于最低形状，延伸其保管物质等，使菌体的代谢活动处于最低形状，延伸其保管期 保管方法：保管方法： 应能能较长期地保管原有菌种的期地保管原有菌种的优良性能，使菌种良性能，使菌种稳定，同定，同时也要思索到方法本身的也要思索到方法本身的经济简便不同的菌种便不同的菌种有不同的保管方法，以便有不同的保管方法，以便长期保藏 酵母菌：定期移植斜面低温保藏法也可采用石蜡酵母菌：定期移植斜面低温保藏法也可采用石蜡油封保藏法油封保藏法 霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法霉菌：斜面保藏法和沙土管保藏法 细菌和放菌和放线菌：普通菌：普通细菌以采用冷菌以采用冷冻枯燥保藏法枯燥保藏法为佳 放放线菌可用沙土或冷菌可用沙土或冷冻保藏法保藏。

短期可采用斜保藏法保藏短期可采用斜面保藏 保藏保藏应留意的留意的问题：： 菌体形状：休眠体菌体形状：休眠体 基基质：：营养养贫乏乏 操作操作过程：不程：不应对细胞呵斥胞呵斥损伤 工业消费中微生物育种的根本方法包括自然选育、诱变育种、抗性菌种选育、代谢控制育种及基因重组定向育种等 育种就是要改善菌种的特性，使之能提高产量、改良质量、降低本钱、改良工艺、方便管理及综合利用等 　 代谢控制育种主要有两个方面： 改动代谢通路的育种 改动代谢自动调理系统的育种第三节第三节 菌种的选育菌种的选育 一、自然选育 采样 增殖培育 从自然界选育菌株 纯种分别 性能鉴定 从自发突变中选育菌株 二、诱变育种二、诱变育种 按照消费的要求，根据生物的遗传和按照消费的要求，根据生物的遗传和变异的实际，用人工的方法呵斥菌种变变异的实际，用人工的方法呵斥菌种变异，再经过挑选、而到达菌种诱变选育异，再经过挑选、而到达菌种诱变选育的目的。

的目的 诱变育种普通采用物理、化学诱诱变育种普通采用物理、化学诱变剂使微生物变剂使微生物DNA的碱基陈列发生变化，的碱基陈列发生变化，以使陈列错误的以使陈列错误的DNA模板构成异常的遗模板构成异常的遗转信息，呵斥某些蛋白构造变异，而使转信息，呵斥某些蛋白构造变异，而使细胞功能发生改动细胞功能发生改动原种〔出发菌株〕纯化斜面培育完全培育基同步培育离心洗涤玻璃珠震荡分散过滤单细胞或孢子悬浮液　　　　　　  活菌计数　　　　诱变处置  诱变处置预备实验　　　　　　　  处置液活菌计数　　　　平板分别　　　　　 　 形状变异并计算其变异率　　　　　斜面培育 初筛、复筛　　　 自然分别和再复筛 保藏及扩展实验　　　　　诱　变　育　种• 出发菌株的选择• 诱变剂的选择• 诱变操作及培育• 突变株的挑选• 突变高产基因的表现• 形状突变• 高产突变• 耐药性突变• 营养缺陷型突变• 构造类似物抗性突变出发菌株〔parent strain〕选择应思索的问题n出发菌株的稳定性：n选器具备优良特性的菌株：n挑选对诱变剂敏感的菌株：n留意菌株的生理形状及生长发育时间：n • 野生菌株• 自发突变后获得的高产菌株• 曾经诱变过的菌株出发菌株•思索实验菌株的遗传背景：各种诱变剂有不同的作用机制，一种诱变剂的作用常主要集中在DNA的某些特异部位上，多次反复用一种诱变因子易出现 “饱和〞或恢复突变景象，因此诱变时常采用多种不同的诱变因子或复合诱变因子。

诱 变 剂 的 选 择菌悬液的制备菌悬液的制备 单细胞悬浮液：单细胞悬浮液：106106个个/mL/mL 孢子悬浮液：孢子悬浮液：108108个个/mL/mL诱变：预实验确定适宜的诱变条件诱变：预实验确定适宜的诱变条件挑选：选择适宜的挑选方法挑选：选择适宜的挑选方法　　随机挑选方法： 菌种经诱变处置后,进展平板分别,随机挑选单菌落,从中挑选高产菌株为了提高挑选效率，开展了一些快速挑选方法〔包括摇瓶挑选法，琼脂块挑选法等〕，并归纳出挑选高产菌的培育基选择准那么: 　 1、制备一系列含有各种类型营养成分〔生长限制要素〕培育基； 　2、防止运用容易同化的碳源或氮源，〔引起分解代谢物阻遏〕； 　 3、参与缓冲液以减少pH的变化； 　 4、确定含有所需的辅助因子 生长因子产生菌〔对应于营养缺陷型〕的挑选：生长因子产生菌〔对应于营养缺陷型〕的挑选： 经过察看分别菌能否促进营养缺陷型〔经过察看分别菌能否促进营养缺陷型〔auxotroph〕的生长，便可检出生长因子产生菌〕的生长，便可检出生长因子产生菌 抗反响突变株〔抗构造类似物〕的挑选抗反响突变株〔抗构造类似物〕的挑选 ：： 构造类似物具有和代谢产物类似的反响调理作构造类似物具有和代谢产物类似的反响调理作用，但又不同于代谢物，不具有正常的生理功能，用，但又不同于代谢物，不具有正常的生理功能，对细胞代谢又妨碍作用。

对细胞代谢又妨碍作用 由于突破了原有的反响调理系统，这些突变株由于突破了原有的反响调理系统，这些突变株就可以产生大量的该种代谢物就可以产生大量的该种代谢物  理性化挑选高通量挑选〔high throughput screening):将许多模型固定在各自不同的载体上，用机器人加样，培育后用计算机记录结果，并进展分析，使挑选从繁重的劳动中解脱出来，实现大规模挑选 细胞模型：察看待测样品对细胞的作用，只能反映药物对细胞生长等过程的综协作用，不能反映作用的途径和靶点包括各种正常细胞和病理细胞 分子模型：包括受体、酶，其特点是药物作用的靶点明确 经过高通量挑选方法，可以发现效果好、临床运用价值高的创新药物，治疗疑问病症 高通量挑选诱变育种的几个概念n形状突变型：指发生细胞形状变化或菌落形状变化的突变 n 型 n生化突变型：没有形状效应的突变型，如营养缺陷型n致死突变型：生活力下降的突变型n条件致死突变型：在某些条件下能成活，在另一些条件n 下是致死的突变型n营养缺陷型突变株：由于代谢妨碍而成为必需添加某种物 n 质才干生长的突变株n温度敏感性突变株：可在某一温度下生长而在另一温度下n 不能生长的突变型 第四节 消费菌株的改良 杂交育种：两个不同基因型的菌株经过结合或原生质体交融使遗传物质重新组合，再从中分别和挑选出具有新性状的菌株。

一、常规的杂交育种:不须用脱壁酶处置，就能使细胞结合而发生遗传物质重新组合 二、原生质体交融：原生质体的制备、原生质体的交融、交融子的选择、适用型菌株的挑选1. 标志菌株的挑选：对两亲株要进展标志，以提高挑选率 原生质体的制备：用相应的酶脱去菌体的细胞壁，制得完好的原生质体原生质体的交融与再生：两原生质体在促融因子的存在下，发生交融，重建细胞壁，构成新的细胞交融子的选择：在选择培育基上，经过两个亲本的遗传标志互补而选择交融子三、DNA重组技术(分子生物学)n目的DNA片段的获得n与载体DNA分子的衔接n重组DNA分子引入宿主细胞n重组体的选择与鉴定n外源基因的表达。