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用QuantityOne进行定量分析的方法生物技术2009-09-06,21:17叶林QuantityOne是Bio-Rad公司的凝胶电泳图像获取、处理以及定量分析软件功能很强大，到底多么强大在这就不说了用处很多，到底多么多在这也不说了，具体功能请参考QuantityOne使用说明及相关教程下面只是QuantityOne用于DGGE结果定量分析的一般操作方法：有下面这么一张DGGE图像，需要分析一下左边第5条泳道的8个条带对应的DNA在样品中占的百分比各分别是多少iHMl!1!♦-常—*TW—LFF-鼻V—_一www^ehnsKyccmn第一步：建立泳道点击菜单栏a-nAutoaean一般情况下QuantityOne会自动识别并建立泳道但也有很多时候不能自动建立泳道，这就需要选择菜单栏aneaean然后输入要建立泳道的数目，手动建立泳道泳道建立后需要调整，在菜单栏a-Eelita中有拉伸、旋转、移动、添加/删除锚点等选项，通过这些选项可以对泳道进行调整，调整后大致如下：wwwyelinsk^com第二步：消除泳道背景点击菜单栏LaneLaneac跳出一个对话框，IILane中选择第二个，然后点一下第5条泳道，SelectedLane的下面会显示SelectedLan:#5(#5)，然后选择LanenIlin中填Sr个e10〜20之间的数(可以多尝试几个，看看效果)，最后点完成操作。

第三步：建立条带点击菜单栏andetectand打开一个对话框，调整Sensitivity和LaneWidth的数值，使每个条带都被检测到，如果条带上面显示的是一条红线，可以在BancBandttr的eStyle栏中选择Brackets，使之显示为括号形式条带建立后图像显示如下：第四步：生成报告点击菜单栏Repo-LaneReport然后点一下第五条泳道，在弹出的对话框的Measurements—栏中选择TraceQty（个人感觉选择这个比较合适，也可以选择其他的看看效果），然后点Report，就看到了每个条带的TraceQty值，这个值与DNA的浓度呈正比，根据这个值计算百分比即可以上仅仅是QuantityOne进行定量的简单流程，非常不具体，一些具体的参数设置及软件的其它功能请参考相关的使用说明或教程另外，不确定上面的操作是否有不当之处，如有请多指教需要特别说明的一点是：对于一个从复杂的环境样品中提取的DNA,经过PCR-DGGE，然后用QuantityOne定量，通过分析每条条带的intensity来计算百分比，然后估计原始样品中各个物种（比如细菌）的百分比，这样的做法是非常不准确的，这种数据发paper可能不会被接受，因为整个过程中存在很多Bias。

同理，T-RFLP也存在类似问题施用教程大全（转贴）1-内容简介凝胶电泳是每个做份子有生命的物质学的同窗天天都要打交道的基本技术电泳然后的信息处理与电泳本身同样重要今朝有大量软件可以用于分析电泳结果，比较有名的比如、、等等今日要向大家介绍的是来自的凝胶定量软件t（还有一个做凝胶分析的软件）e这个软件的最新版本可以在的主页不收费下载今朝的最新版本是版的定量方法）的分析功能顾名思义首要用来举行凝胶或培养皿的荧光定量分析它的分析功能或说分析方式首要有种：泳道条带轨迹定量法；等高线直接定量法；菌落计数；份子量测定这三种方法中施用最为利便也是最为广泛的应该是等高线定量法（）它经由过程半AUTO描绘电泳条带的等高线边沿来得到等高线区域内部平面或物体表面的大，再将该平面或物体表面的大乘以区域内平均光疏密程度值当到条带内部总的信号量固然这种分析方法的蠹弊显而易见：无法同等得排除不同泳道的配景亮度；等高线的绘制处于“半AUTO”状态，即需要人为判断作为等高线标准的电泳条带的边沿；最致命的是在几个电泳条带距离十分接近的时辰几乎无法绘制纯一条带的轮廓（常出现持续的几个条带等高线相连而无法分离出独自条带的轮廓）。

三种方法中个人感觉最为科学和严谨的应该是泳道条带轨迹定量法（TT）这种方法施用起来步调较为繁琐，必需经由过程泳道识别--电-泳条带识别两个持续的步调才气举行定量然而这种方式的最大长处在于它可以纯粹丢弃人为主观因素举行全AUTO定量他的定量方式为：首先根据不同电泳条带的光疏密程度值绘制光疏密程度曲线，然后计算光疏密程度曲线下平面或物体表面的大作为电泳条带的定量根据大家可能会问他能不能排除泳道配景？谜底是必定的，它能够最大程度的排除不同泳道之间的配景差异，让各个泳道上的不同电泳条带在一条几乎不异的开始跑线上举行相比较这个配景排除功能是等高线法无法做到的（等高线法也有基本的配景排除措施，但是和泳道/条带轨迹定量法的配景排除不是一个等级的等高线法只能排除同一泳道上的配景，而不能均等的排除不同泳道的配景)另外泳道条带轨迹定量法还可以联合aussodelBanc对紧密相连的电泳条带举行分析，而这种条带也是等高线法无法分析的我们这次重点学习这个方法第三个分析功能是菌落计数(ColonyCounting)这个功能其实很实用，可以分析蓝白筛选的结果但是很奇怪ycomputer居然无法运行这个功能，因此无法向大家介绍了。

另外uantityOne还可以经由过程回归曲线测定份子量下面让我们了解一下uantityOne经常使用的基本菜谱操作打开文件：由于uantityOne是Bioa的硬件组成一套软件，因此uantityOne可以ATO输入来自Bioa公司的凝胶分析仪的数据具体支持哪些硬件大家可以在“EditPreerencemagers”里面设置如果您的实验室没有接纳Bioa的硬件设施也没瓜葛您只要将电泳图片用ACDSee等程序转换为TIF图片格式就能够被uantityOne识别了注重uantityOne只支持位和位灰度的TIF文件uantityDne彷佛有一个小bug，就是在按“Open”然后并没有立刻弹出资源管理器让你选择方针文件的位置其实你只要将鼠标在荧幕右下方点击一下，资源管理器就会乖乖弹出来了.uantityOne只能分析白的颜色配景玄色条带的电泳图而我们正常环境下得到的一般都是玄色配景白的颜色条带的电泳图我们可以在“ImageInvertdata中将图片颜色举行反转，然后即可以用uantityOne举行分析了.文字注解：uantityOne提供基本的文字注解功能您可以在您的电泳图片上记载您的分析结果比如电泳条带的份子量、光疏密程度值、事物的量等等。

这个功能可以经由过程“EditTetOverlayTools”来使成为事实在弹出的浮动工具栏入选择“ABC”或“”就能够举行文字输入和画标志线的操作光疏密程度工具：在“ViewPlotDensity”的下级菜谱中大家会见到几个和电泳条带光疏密程度值相干的预示选项大家可以别离选择不同的选项感受一下它们之间的不同选择方法是点击响应的下级菜谱比如“PlotCrossSection”，然后将变成带一个蓝色感慨号的鼠标移到您想懂得光疏密程度的位置，点击一下就会预示该处的光疏密程度相干信息鄙人面这幅图片中我们可以看见两条黄线交叉处的电泳条带的相干信息上方的一串曲线是不同泳道之间在同一平行线上的光疏密程度比率曲线；左边是黄线交叉处地点泳道的几个电泳条带的光疏密程度漫衍环境3DViewer：在“View3DViewer”菜谱中大家会看到一个有趣的功能叫做3DViewer这个玩意按照Bioa的说法可以辅助鉴别几条紧密相连在一路的电泳条带的漫衍环境大家只要选择了这个号令后鼠标就会一个“”型，然后将型移动到您感兴趣的位置，拖动鼠标画出一个正方形区域，然后用鼠标双击，uantityOne就会将这块区域按照gauss漫衍规律渲染成一个三维模子，颇有意思。

但个人感觉这个功能噱头多于实用uantityC的基本配景排除功能最起头的时辰我们就说过uantityOne的等高线定量模式也有一种比较基本的配景排除方法这个方法同样也合用于泳道/条带定量模式此刻我们就来学习这个方法基本配景排除的功能位于“ImageSubstractbackgroud..."和“ImageFilterWizard...”这两个菜谱ImageFilterWizard：这个功能是对原始图片做一些开真个加工，主如果祛除一些图片上的“斑点”这些斑点首要有两种类型：一种是深色的“胡椒面”型和淡色的“食盐”型，两种斑点都可以毫不犹豫地去除从“ImageFilterWizard..."菜谱调出向导菜谱后选择“pepper”和“salt”，下面两个选项可以按照程序默许的选项，然后“OK”就能够完成这第一步的降噪历程ImageSustractackgrou这个功能是真正对图片配景举行清理的工具（区别于“ImageFilterWizard...”的降噪模式）只是这种清理是一种“全局”型的清理，即它以不异的参量对每条泳道举行配景清理然而在清理方式上它照旧可以分成两种不同的方式：BackgroudBox：—种是以一个局部小平面或物体表面的大为标准配景，将整张电泳图片上所有比该区域光疏密程度值低的区域全部漂白。

这种发型称为“BackgroudBox”操作时用鼠标选中对话框下部左侧的“BackgroudBox”按键，然后用鼠标在电泳图片上选择一块颜色近乎配景色，色泽比较匀称的区域，用鼠标拖动画出一个正方形开释鼠标后程序就会当即对电泳图片举行降低配景的处理；BackgroudStripe：相对于“BackgroudBox”来讲是一种更加智能化的处理方式它出格合用于梯度凝胶，即凝胶浓度由上至下依次变化由于梯度胶的光疏密程度值在一定距离内不断变化，因此如果接纳“BackgroudBox”的方法除配景就会发生偏差uantitOn此时提供一种随着凝胶浓度变化而变化的除配景方式就是“BackgroudStripe”和“BackgroudBox”近似，选择右下角的“BackgroudStripe”按键，然后用鼠标沿着电泳泳道拖放形成一个狭长的剪影带（Stripe），这个剪影带内部的光疏密程度值顺着泳道逐渐升高或降低uantitOne根据这个Stripe可以动态的对整张图片的配景举行剪影比如泳道肇始处光疏密程度低，那末uantitOn在此处的剪影值也降低；随着Stripe向前延长，光疏密程度值逐渐升高，uantitOne也同样不断加大剪影的强度。

这样一来就能够排除由于梯度胶带来的配景不相符的影响因素uantit的电泳泳道分析功能创建泳道前面说过QuantityOne之所以强大是因为它具有的泳道/条带轨迹定量法此刻我们就来学习一下如安在电泳图片上创建泳道（Lane）和怎样举行针对不同泳道的配景排除创建泳道：首先打开我们要分析的电泳图片（以卵白质电泳为例）然后选择“LaneutFramelanes”这时候如果您的电泳图片比较标准的话，uantitOr就会识别出每条电泳泳道的位置，而且将各个泳道的路径用一条红线标画出来；如果您对软件标志的泳道不甚对劲，您可以经由过程“LaneEditFrame”下级各个子菜谱提供的功能对泳道框架位置、大小等举行调节调节方法就是经由过程鼠标的拖放来使成为事实，大家可以本身体验一下；如果您只消分析此中几个泳道的数据而不想其它泳道的标志滋扰您的眼看东西假想线，您可以经由过程“LaneSingleLaneRemove。