组织培养实验-MS培养基及配制注意事项.doc

一、MS培养基母液的配制母液成分1倍培养基用量浓缩倍数称取量(mg)母液体积(ml)配制1升 培养基吸 取量(ml)编 号种类1大元素kno3190010190001000100NH4NO316501016500MgSO4 • 7H2O370103700KH2PO41701017002CaCl2 • 2H2O44010440010001003微 量■ ■兀素MnSO4 • 4H2O22.31002230100010ZnSO4 • 7H2O8.6100860H3BO36.2100620KI0.83100083010001Na2MoO4 • 7H2O0.251000250CuSO4.5H2O0.025100025CoCL2.6H2O0.0251000254铁盐Na2-EDTA37.31003730100010FeSO4.4H2O27.810027805有机物甘氨酸2.05010050010盐酸毗哆醇(VB6)0.55025盐酸硫僅素(VB1)0.1505烟酸0.550256肌醇10050500050010注意：1.除CaCl2-2H2O单独配制外，大量元素按照使用时高10倍的数值称取，将各种化合物称量后，分别川少量水在不同的容器内充分溶解，然后在5(X)ml烧杯中按顺序加 入备溶液，加适量蒸镉水，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馅水定容至刻度, 置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称(或编号)，浓缩倍数，配制口期和配制者姓名, CaCI2-2H2O配制同上置于另一小口瓶中。

2.微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取,分别将各种化合物称量除铁盐(FeSO4-7H2O和 Na2-EDTA.2H2O)作为一纽.单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少最蒸徭水溶解示,定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签3. 铁盐配制将FeSO4-7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml熬憎水中，加热，（很 重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml,置于小口瓶中，贴 上标签4. 有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别 称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签5. 母液最好在2〜4C的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐 母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用A. 制备母液和营养培养基时，所用蒸懾水或无离了水必须符合标准要求，化学药品必须 是高纯度的（分析纯）B. 称量药物采用高灵敏度的天平，毎种药品专用一药匙二、培养基配制和灭菌%1. 养培养基配制程序（一）.母液吸取量的计算配制培养基的升数母液吸取量二母液体积（CC） X 母液浓缩倍数（二）备种母液按顺序编号排列A.大量元素；B. CaCl2.2II2O ； C.微量元素；D.铁盐； E.有机物；F.生长素荼乙酸（NAA）：配制0. 5mg/ml的NAA称取50mg , NAA用少量95%酒精溶解 后加蒸馄水定容至1000ml； G..细胞分裂索、激动索（KT）配制0. 5mg/ml的KT称50mgKT 用少量IN HCL溶解后，加熬憎水定容至lOOmh（三）配制培养基（1000ml）1. 琼脂：称取5〜7g琼脂，加入300ml蒸憎水，加热溶解直至完全溶解为止.2. 蔗糖3%用质量较好的白糖代替，称取30g白糖,溶于溶有琼脂的300ml蒸馆水中。

3. 各种母液的吸取（培养基1L）（1） 用50ml量筒量取大量元素母液（A）和CaCl2-2H2O母液（B）各100ml（2） 分别用10ml移液管或吸管吸取微量元素（C）,铁盐（D）母液备10ml（3） 用10ml移液管或吸管吸取有机物（H） 10ml（4） 移取激素将上述溶液全部混合于琼脂与蔗糖溶液中，混合均匀后，加热至80C左右，用酸度计 或精密PH试纸测定培养基的PH 一般要求5.8〜6.0,过酸过碱则用IN NaoH和IN HCL调 整1. 分装：用一个接有胶管的分装器趁热装培养基，1000ml培养基分装到25-30个三角瓶 中，每个三角瓶约30ml左右（一般占试管、三角瓶容量1/4〜1/3左右）注：培养基勿碰瓶 壁1. 包装：分装好的三角瓶用封口膜包扎好，标明培养基代号即可进行火菌用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，川过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水 洗涤干净，然后按次序放冋原处三、髙压蒸汽灭菌锅的使用方法具体操作步骤：1. 高压锅放水至平把架；2. 把包扎好的培养基装入高压锅；3. 盖上热压锅盖，上紧螺帽（注意对角拧紧螺帽）关上气阀和安全阀.4. 然后接通电源.5. 压力计升至0.05MPaW,打开放气阀，排除冷空气（此步很重要）。

6. 排除冷空气后，关闭放气阀，待压力升到0.11 MPa位置时，开始计算灭菌时间，具体方 法：当压力锅指针升至0.12MPa时，关闭电源，待指针下降至0.11 MPa时接通电源，不断 重复此操作过程，维持20分钟7. 火菌时间达到20分钟后，除去电源，打开放气阀（注意要逐渐放气）待高压锅内的空气完 全排除后，打开热圧灭菌锅盖（注意对角扭松螺帽）稍待冷后再把培养基取出8. 经过灭菌的营养培养基不宜放置太长，应尽早使用，但为了在使用前能检杳培养基有无 微生物污染，可将培养基置于25C下保存4天，如果培养基需要贮存较长时间，可在4C低 温下保存灭菌高压锅有大型卧式、中型立式、小型手提式等多种型号和规格，无论哪种型号，操 作的步骤都很相近进水一放进培养基一盖紧锅盖一关上放汽阀一检杳安全阀一接上加热源一待压力升至 0.05MPa时排锅内冷空气 关上放气阀-*0.11MPa（12rC）T灭菌20〜25分钟，保持稳定压力 一除热源〜逐渐打开放气阀〜锅内空气排除完后f开放锅盖一稍冷后取出培养基四、无菌操作技术（一）植物材料表1:1消毒剂灭菌从外界或室内选取的植物材料，都不同稈度地带有乞种微生物这些污染源一旦带入培养基, 便会造成培养基污染。

因此，植物材料必须经严格的表面火菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过穆叫做接种1 .接种步骤:第一步：清理材料ff流水冲洗f 一加入吐温（或洗衣粉）清洗 H来水冲洗第二步：对材料的表血浸润火菌：70%酒精浸10・30秒一无菌水第三步：灭菌剂处理〜〜0.1・1%升汞5・8min （或其他灭菌剂）第四步：无菌水进行冲洗注意事项：1 .灭菌剂一般要临时配制，现配现用.升汞可以短期储存.2 .对去除较容易的灭菌剂灭菌后无菌水冲洗3・4次，升汞一般8次，每次不少于3 min3.灭菌时要轻轻的搅拌，消除气泡，使消毒更彻底.4 .灭菌时间是从倒入消毒液开始，至倒入无菌水时为止5 .灭菌液要充分浸没材料2 •无菌操作可按以下步骤进行：（1） 在接种3天前用甲醛熏蒸接种室，并于接种前3小时打开其内紫外线灯进行杀菌；（2） 在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及台上的紫外线灯；（3） 接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿拖鞋等；（4） 上工作台后，用洒精棉球搽拭双手，特别是指甲处然后搽拭工作台面；（5） 先用酒精棉球搽拭接种T具，再将辍子和剪刀从头至尾过火一遍，然后反复过火尖端 处，对培养皿要过火烤干；（6） 接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；材料吸干后，一手拿银了、一手拿剪刀或解剖刀，对材料进行适当的切割。

如叶片切成0.5cm2 的小块；茎切成含有一个节的小段微茎尖要剥成只含1・2片叶原基）在接种过稈中要经常 灼烧接种器械，防止交叉污染7） 接种完毕后要清理干净T作台，可用紫外线灯灭菌30分钟，若连续接种，每5天要大 强度灭菌一次常用植物激素类别名 称缩写词分子量使用浓度范围母液配制说明生长素2, 4—二氯苯氧乙酸2, 4-D221.00.001 — 1 Oing/L生长索通常 用NaOH溶 液滴至溶解 成溶液能溶于乙醉IAA易被植物 细胞所氧化故培养基中很 少单独使用a 一茶乙酸NAA186.20.001 一 10mg/L财味一3 一乙酸IAA175.20.001 — 10mg/L刪味一3 — 丁酸IBA203.20.001 一 10mg/L细胞分裂6—节基氨基噪吟BA225.2分裂索通常 能溶于稀 NaOH,存水 乙醉或稀盐 酸玉米素不耐 热，不能高压 灭菌6—糠基氨基喋吟KT215.2N—异戊烯氨基喋吟（玉米索）ZT219.2赤霉素赤霉素ga3346.4能溶于乙醉不耐热不能高 圧灭菌在愈伤 组织和悬浮培 养物的启动和 保持生长时才 需要有时小植 株再生时也需 要四、常用药品的配置方法l.lmol/L HC1的配制：根据盐酸的密度37%盐酸溶液的密度为1.19克/毫升，假设要配制 1000ml lmol/L HC1,则需要盐酸的物质的量为lmol,所以需要量取37%的盐酸为 l*36.5/37%/1.19=82ml2.1mol/L的NaOH的配制：称4OgNaOH,然麻融于1000ml的蒸催水中。

定容到100ml）3.95%的酒精配制成75%的酒精：用量筒量取750ml的95%酒精加入200ml的蒸馆水即可 得到75%的酒精如果用无水酒精配制75%的酒精，则量取750ml的无水酒精，再加水250ml04,0.1%的升汞配制：先称取1克升汞粉末，然后用蒸僭水溶解最后定容到1000mlo5. lmg/m 1的2・4・D的配制：称取0.1g2.4・D,用少S 1 mol/LnaOH或酒精助溶，然后定容到 lOOmlo6.1 mg/ml的6-BA的配制:称取0.1g6-BA,用少量lmol/L HC1或1 mol/LNaOH助溶，然后 定容到lOOmlo7O5mg/nil的NAA的配制：称取0.05gNAA,用少量95%酒精助溶，然后定容到100ml。