自由基PPT课件.ppt

MDA,MDA 丙二醛,英文名：Malondialdehyde；malonic dialdehyde；Propanedial 简称：MDA CAS：542-78-9 结构式：OHC-CH2-CHO 分子式：C3H4O2 （同丙烯酸） 分子量：72.0634 无色针状晶体，熔点 7274，一般含两个结晶水，60下真空干燥可得无水物，易潮解，纯的丙二醛在中性条件下稳定，但在酸性条件下不稳定,植物在长期进化过程中形成了受遗传性制约的逆境适应机制,活性氧代谢在其中占据重要地位,是植物对逆境胁迫的原初反应当植物处于各种逆境下,自由基的产生与消除就会遭到破坏,通过Haber-Weiss反应产生大量的活性和毒性极高的OH侵害细胞内的大部分生物大分子这种积累的自由基将会引发膜脂发生过氧化,造成细胞膜系统伤害MDA是膜脂过氧化的主要产物之一因此,MDA含量高低和细胞质膜透性变化大小可反映细胞膜脂过氧化作用强弱和质膜破坏程度的重要指标星星草,膜脂过氧化的启动是一个比较复杂的过程,它的发生由酶促反应和非酶促反应所引起催化质膜多元不饱和脂肪酸进行加氧反应的脂氧合酶(lipoxygenase,LOX)是酶促反应中的关键酶,干旱胁迫可诱导LOX活性上升。

可以启动非酶促反应的因子有许多种,轻基自由基是其中重要的一个氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体的新陈代谢过程中起着重要的作用，正常情况下两者处于协调与动态平衡状态，维持着体内许多生理生化反应和免疫反应一旦这种协调与动态平衡产生紊乱与失调，就会引起一系列的新陈代谢失常和免疫功能降低，形成氧自由基连锁反应，损害生物膜及其功能，以致形成细胞透明性病变、纤维化，大面积细胞损伤造成进神经、组织、器官等损伤这种反应就叫脂质过氧化膜脂过氧化,脂质过氧化过程中发生的ROS氧化生物膜的过程，即ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物(Lipid PerOxide, LPO)如丙二醛 (Malonaldehyde, MDA)和4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal,HNE)，从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变,最终导致细胞结构和功能的改变 ROS：需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇( reactive oxygen species, ROS)，包括：O2 -、H2O2 及HO2、OH 等,膜脂过氧化对植物体的伤害,1膜脂过氧化对蛋白质结构和功能的损伤及其对植物细胞蛋白质代谢的影响 膜脂过氧化的中间产物自由基和最终产物丙二醛(MDA)都会严重地损伤生物膜。

膜脂过氧化对生物膜的损伤主要是由膜中蛋白 质的聚合和交联以及膜中类脂的变化引起膜脂过氧化的中间产物自由基能够引发非特异性的氢抽提作用(hydrogen aostraoblon) 和由此而产生的化学加成作用，从而对蛋白 质分子进行氢抽提而生成蛋白质自由基 蛋 白质自由基与另一蛋白质分子发生加成反 应，生成二聚蛋白质自由基，依次对蛋白质分 子不断地加成而生成蛋白质分子的聚合物 蛋白质中含巯基的氨基酸易被氧化生成二聚 体此外，膜脂过氧化的最终产物MDA与 蛋白结合引起蛋白质分子内和分子间的交联 生物膜中结构蛋白和酶的聚合和交联， 使它们的结构功能和催化功能发生变化2膜脂过氧化对植物细胞膜系统结构和功能的影响 （1）膜脂过氧化对植物知胞膜系统膜脂 组分的影响 膜脂过氧化是在膜脂不饱和 脂肪酸中发生的一系列自由基反应，显然 脂过氧化会降低膜中不饱和脂肪酸的含量 然而在植物中这方面的直接证据却极少 （2）膜脂过氧化对膜流动性和膜脂相分离的影响 现代生物膜的概念认为，具有正常膜功能的生物膜应处于一种流动的液晶态，膜的流动性保证了膜的能量转换、物质运输、信息传递和代谢词节等过程的正常进行影响膜流动性的因素是多方面的， 膜脂过氧化以及膜脂过氧化的产物MDA含量的增加也与膜流动性的变化有关。

膜脂过氧化降低膜脂的不饱和度，并引起膜蛋白的变性，可能是膜脂过 氧化引起膜流动性降低的重要原因3)膜脂过氧化对植物蛔胞质膜透性的影响 质膜是细胞与环境之间的界面，各种逆境对细胞的影响首先作用于质膜，逆境 胁迫对质膜结构和功能的影响通常表现为选择透性的丧失，电解质和某些小分子有机物大量渗漏有关膜脂过氧化对植物细胞质膜透性的影响已有大量报道几种主要逆境胁 迫所引起的膜脂过氧化及MDA的积累均使植物细胞质膜透性增大 3.膜脂过氧化对植物光合作用的影响 膜脂过氧化对植物光合作用有显著的影 响低温下黄瓜幼苗于叶膜脂过氧化产物 MDA随低温持续时间的延长和胁迫程度的加强而增加，光合速率和叶绿素荧光则随之下降无论延长胁迫时间或增加胁迫强度、 膜脂过氧化产物MDA含量与光合作用均呈一定的负相关，表明膜脂过氧化对植物的光合作用有抑制作用膜脂过氧化还会损伤叶绿体的超微结构，引起叶绿素的降解及其特性变化，使光合羧化酶失活从而影响植物的光合作用4膜脂过氧化对植物呼吸作用的影响 植物细胞线粒体膜脂脂肪酸不饱和度较高，内膜磷脂占总磷脂的70%80，而在这种磷脂中亚麻酸占总脂肪酸的60% ，而且线粒体是高效率利用分子氧的亚细胞器，其中部分基态氧能粒体内膜进行单电子还原而，并启动不饱和脂肪酸的过氧化反应。

可见线粒体是植物细胞中易受自由基攻击而发生膜脂过氧化的部位由逆境胁迫和衰老引起的植物膜脂过氧化对线粒体结构和功能的损伤主要包括以下几个方面：损伤线粒体的超微结构；提高线粒体膨胀率；降低植物线粒体的呼吸控制比率；引起植物线粒体细胞色素氧化酶的活性下降等膜脂过氧化通过引起植物线粒体结构的损伤和呼吸酶活性的下降，从而影响细胞的呼吸作用 5.膜脂过氧化对植物纽胞保护酶活性和抗氧化物含量的影响 植物对膜脂过氧化有酶促和非酶促两类防御系统，超氧物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(OAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(AsAPOD)等是酶促防御系统的重要保护酶，抗坏血酸(AsA)和还原型谷胱甘肽(GSH)等是非酶促防御系统中的重要抗氧化剂 有关这些保护酶和抗氧化物在防御膜脂过氧化中的作用己有大量研究丙二醛（MDA）含量的测定,丙二醛是膜脂过氧化最重要的产物之一植物在逆境下遭受伤害与活性氧积累诱发的膜质过氧化作用密切相关原理,植物在逆境下遭受伤害（或衰老）与活性氧积累诱发的膜脂过氧化作用密切相关，膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等其中丙二醛（MDA：Malondialdehyde）是膜脂过氧化最重要的产物之一，因此可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

丙二醛在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川），该物质在532 nm处有一吸收高峰，并且在660nm处有较小光吸收根据其532 nm的消光值可计算出溶液中丙二醛的含量醛、可溶性糖对此反应有干扰，在450 nm处有一吸收峰，可用双组分分光光度法加以排除原理,硫代巴比妥酸,,丙二醛,3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（三甲川）,仪器设备,分光光度计； 研钵； 剪刀； 恒温水浴； 试管：20 mL4 离心机材料,正常生长的以及经逆境处理的小麦、玉米或其他植物的叶片方法与步骤,1取小麦植株上不同叶位的叶片35片，洗净擦干，剪成0.5 cm长的小段，混匀 2称取叶片切段0.3 g，放入冰浴的研钵中，加入少许石英砂和2 mL 0.05 mol L-1磷酸缓冲液，研磨成匀浆将匀浆转移到试管中，再用3 mL 0.05 mol L-1磷酸缓冲液，分三次冲洗研钵，合并提取液 3在提取液中加入5 mL 0.5 %硫代巴比妥酸溶液，摇匀 4将试管放入沸水浴中煮沸10 min，（自试管内溶液中出现小气泡开始计时）到时间后，立即将试管取出并放入冷水浴中。

5待试管内溶液冷却后，3000g离心15 min，取上清液并量其体积以0.5 %硫代巴比妥酸溶液为空白测532 nm、600 nm和450 nm处的消光值计算结果,式中，Vt：提取液总体积（mL）； Vs：测定用提取液体积（ml）； FW：样品鲜重（g）注意事项,1可溶性糖与TBA显色反应的产物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰 2低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显色反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+（最终浓度为0.5 nmol L-1） 3如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机离心膜脂过氧化的缓解,NO是广泛分布于生物体的一种气体类生物活性分子,属于活性氮(reaetivenitrogenspecies,RNS)范畴植物体内通过酶促和非酶促途径产生NO其中,酶促途径NO的产生主要是由一氧化氮合酶(NOS,EC1.r4.r3.39)或硝酸还原酶(NR,Ee1.6.6.1/2)催化造成产生No,而非酶促途径则有酸性环境下的硝酸盐还原和光参与的类胡萝卜素转化等。

Beligni和Lamattina(1999)认为植物No具有双重生理效应,其中高浓度NO具有生理毒性,而低浓度则有保护作用,并与细胞的微环境和NO的实际浓度有关例如,低浓度NO可以促进植物的生长发育,也可以缓解盐胁迫诱导的小麦叶片膜脂过氧化,提高耐盐性大量研究表明,UV-B辐射增强使植物的膜脂过氧化加剧,膜透性增大膜脂过氧化是酶促反应和非酶促反应共同作用的一个复杂过程,其中LOX是引起酶促膜脂过氧化的关键酶,丙二醛是膜质过氧化的主要产物之一,能够引起细胞膜功能紊乱植物在长期的进化过程中形成了清除活性氧的保护系统,包括过氧化氢酶(CAT)、抗坏血酸过氧化物酶(APX)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)等对于UV-B辐射引起的损伤,植物虽然能依赖自身的抗氧化系统对其修复,但如果损伤严重,植物内膜系统内的抗氧化酶类也会有所损伤,朱新军研究发现He-Ne激光可提高抗氧化酶活性利用He-Ne激光辐照增强UV-B辐射的小麦幼苗,发现He-Ne激光对增强UV-B辐射下植物叶片膜脂过氧化作用有缓解效应抗氧化剂,抗氧化剂（ Antioxidants）是阻止氧气不良影响的物质 它是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。

根据溶解性抗氧化剂可分为两大类：水溶性抗氧化剂和脂溶性抗氧化剂水溶性抗氧化剂通常存在于细胞质基质和血浆中，脂溶性抗氧化剂则保护细胞膜的脂质免受过氧化 这些化合物或在人体内生物合成或通过膳食摄取不同抗氧化剂以一定范围的浓度分布于体液和组织中 谷胱甘肽和辅酶Q10主要存在于细胞中，而其他抗氧化剂比如尿酸它们的分布更为广泛（详见下表）一些抗氧化剂由于既有抗氧化作用也是重要的病原体和致病因子所以只存在于某些特定机体组织中 一些化合物通过与过渡金属配位螯合来阻止金属在细胞中催化自由基的产生，从而起到抗氧化防御的作用这种抗氧化防御手段中特别重要的一点是要将铁离子通过配位螯合隔离起来，因为铁离子是一些铁结合蛋白（iron-binding proteins）比如运铁蛋白和铁蛋白能发挥作用的关键硒和锌通常被认为是抗氧化营养素（antioxidant nutrients），这两种元素本身没有抗氧化作用但会对一些抗氧化酶的活性起到作用抗坏血酸 抗坏血酸或称维生素C是植物和动物体内的单糖氧化-还原催化剂在灵长类动物的进化过程中，突变的发生使得机体中一种用于合成维生素C所必需的酶丢失，所以人类必须从饮食中摄取维生素C。

其他大部分动物都具备在体内合成维生素C的功能因而无需通过食物补充通过氧化L-脯氨酸残基得到4-羟基-L-脯氨酸可将前胶原（procollagen）转化为胶原蛋白，这个过程需要维生素C的参与，氧化后。