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细胞培养准备一、 实验器材：1・培养瓶 离心管 注射型滤器（正床过滤器）2•手术器材：银子手术剪止血钳注射器针头3. 包装用品支架：饭盒包装纸硫酸纸棉线准备：1. 清洗：刷洗，煮沸后加洗剂冲洗，振荡冲洗15-20次酸泡，烤干后泡24h浸泡，去离子水2次,每次24h,新玻璃器材5%HCL2. 包装：瓶管口，双层纸；盖玻片条；瓶塞；吸管，管底垫棉花，管头塞棉花;饭盒：盒底垫纱布，瓶口向下，液体瓶插针头，盖纱布、盖子滤菌器，双层滤纸3. 消毒高圧蒸汽，紫外线，滤过消毒化学消毒，酒精，新洁尔灭，过氧乙酸（无菌室），火焰消毒二、 实验仪器：CO2培养箱：电源，温度，湿度，5%CO2注意事项：1. 定期紫外线，酒精消毒2. CO2气压定期测试3. 供气中断拧紧瓶盖4. 定期加水，保持湿度5. 培养瓶酒精消毒入箱倒置显微镜普通光学显微镜24孔培养板酸度计蒸汽灭菌器离心机 超净工作台 血球计数板三、药品及细胞用液:之后将乙液缓缓加入甲液 用滤纸滤过后，加入氯仿 )倍，经 116C, 15 分two big药品：75%酒精，0.4%台盼蓝I.平衡盐溶液:HANK S 液：甲液：NaCl80.0gKC14.0gCaC12l.4gMgSO4-7H2O2.0g乙液：Na2HPO4 • 12H2O1.52gKH2PO40.6g葡萄糖lO.Og丙液：1 %酚红溶液16ml将甲、乙各种试剂按顺序分别溶于450ml蒸倔水中, 中，边加边搅拌，再加入内液，补蒸水至1000ml,2.0ml,置于2・8C保存。

使用时，用蒸饰水稀释钟灭菌使用前用7・5%NaHCO3调pH至7.2-7.4o0.01M PBS (pH7.2-7.6)：8.5gNaClNa2HPO4 1.4gNaH2PO4 0.2g溶于1 ()()()ml蒸锚水中Two big2. 天然培养基：胎儿牛血清two small3. 消化液：膜酶液，胶原酶液，0.3%EDTA,TE4 •青链霉素溶液：10ml HANK S液中溶解100万单位硫酸链霉素配成硫酸链霉素溶液，取出 8ml硫酸链霉索溶液溶解80万单位的青霉索钠配成每毫升青霉索、链霉素各10 万单位的母液使用吋，在100ml培养基中加母液0.1ml,则培养基内青霉索、 链霉素最终使用浓度为100单位/ml5.10%RPMI1640 培养基1640培养基90ml中加入10ml胎牛血清混匀，置4C冰箱短期备用One big6. 酸性磷酸酶作用液：蒸耀水 90ml0.2mol/L 醋酸缓冲液(pH4.6) 12ml5 %硝酸铅 2ml3.2% 0 ■甘油磷酸钠 4ml先将蒸倔水和醋酸缓冲液混合，随后分成大致相等的两份，一份中加醋酸铅溶液, 另一份加片油磷酸钠溶液，然后再将两者缓缓混合，边混匀边搅匀。

若pH >5.0,可加少许醋酸调节，临用前配置配好后的作用液应透明无絮状悬浮物和沉淀, 否则严重影响实验结果One big7. 吉姆萨染液:吉姆萨染料(粉末) 0.8g甲醇 50ml甘油 50ml先将吉姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研磨溶于甘油中，置于56C水温箱内， 90-120分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即对使用此 染液放置室温阴暗处，吋间越长越好使用染液可临吋配置：姬姆萨染液1ml, 加l/15mol/L磷酸盐缓冲液10ml混匀，即可使用One big10%多聚甲醛缓冲液:4g50ml多聚甲醛蒸锚水 在通风橱内加热使之解聚，完全溶解，冷却，用0.2mol/LPB (pH7.4-7.5)定容致 100ml o细胞培养过程小鼠腹腔巨噬细胞的培养与纯化（1） 实验前三天，向小鼠腹腔内注入无菌RPMI1640 1ml （勿注入肠内）,以 刺激腹腔产生大量的巨噬细胞51注射器（2） 三天后引颈处死小鼠，手提鼠尾将小鼠全浸入75%乙醇中3-5秒烧杯（3） 置小鼠于超净工作台中的灭菌托盘中，持锡撕开腹部皮肤，但勿伤及腹膜 壁，暴露出腹膜壁用75%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸2-3ml RPMI1640液注 入腹腔中，同吋用手指从两侧压揉腹膜壁，使液体在腹腔内流动。

用针头轻挑起 腹壁并微倾向一侧使腹腔中液体集中于针头下吸取入针管内，小心拔出针头， 把液体注入离心管5ml（4） 1000转离心10分钟后，去上清，加RPMI1640 （含100单位/ml青链霉 素，10%无支原体胎牛血清）培养基重新混匀5） 用RPMI1640 （含100单位/ml青链霉素,10%无支原体胎牛血清）接种 于有盖玻片的培养瓶中进行原代培养，放入CO2培养箱中（37C, 5%CO2） 培养2-3小时6） 除去培养液，用Hanks液冲洗培养孔2-3次，去除未贴壁细胞，纯化巨 噬细胞，再用RPMI1640液冲洗1・2次,再加入RPMI1640 （10%无支原体胎牛 血清）培养液备用7） 细胞的传代培养（8） 普通光镜下细胞计数，鉴定，检测活性小鼠腹腔巨噬细胞的鉴定用酸性磷酸酶法鉴定口噬细胞1） 取出有细胞贴壁的盖玻片放于载玻片上，用HANK S液冲洗2・3次，放 入冰箱（4C）, 30分钟后取出，在细胞贴壁细胞上滴加10%中性甲醛溶液数滴, 放入冰箱（4C）固定30分钟2） 自来水漂洗5分钟，把水沥干3） 在固定好的细胞上滴加酸性磷酸作用液数滴，37C处理30分钟4） 自来水漂洗3・5次。

5） 在细胞上滴加1%硫化鞍3・5分钟6） 自来水冲洗3・5次，甩干7） 在细胞上滴加吉姆萨染色液染色15分钟8） 自来水冲洗3・5次去除多余染液，用磷酸盐缓冲液临吋封片，镜检玻璃器皿:1・浸泡：洗涤剂中浸泡数小吋，刷洗，5%HCL浸泡12h以JL2. 刷洗：在洗剂中毛刷（软毛，轻用力，注意更换），充分冲洗，晾干3. 浸酸：6h以上，最好过夜 清洗液配方：强次弱重洛酸钾(g) :63 120 100浓 H2S04(ml):1000 200 100蒸锚水(ml)： 200 1000 10004. 冲洗：自來水（压力），瓶内盛满水，倒空10次以上，重蒸水浸洗2・3次，烘 干后包装胶塞：水浸泡，2%NaOH煮沸lOmin,自来水冲洗晾干，1%稀HCL浸泡30min, 自来水，重蒸水冲洗3次，烘干备用塑料：水泡，H来水冲洗（不刷洗），2%NaOH过夜，鬥来水冲洗，1%稀HCL 浸泡30min,自来水,重蒸水冲洗3次,烘干备用。