第四部分DNA重组教学课件.ppt

第四章第四章 DNA重组重组　 DNA分子内 或分子间发生遗传信息的重新组合，称为遗传重组 (genetic recombination),或者基因重排(gene rearrangement) 重组产物为重组体DNA (recombinant DNA) DNA的重组广泛存在于各类生物真核生物基因间重组多发生在减数分裂(meiosis)时同源染色体之间的交换(crossover) 细菌及噬菌体的　基因组为单倍体，来自不同亲代两组DNA之间可通过多种方式进行遗传重组 DNA重组对生物进化起着关键的作用生物进化是生物随时间发生变化和多样化的过程生物进化以不断产生可遗传的变异为基础首先有突变和重组，由此产生遗传的变异，然后才有遗传漂变(genetic drift)和自然选择(natural selection)，才有进化可遗传变异的根本原因是突变然而，突变的机率很低，而且多数突变是有害的如果生物只有突变没有重组，在积累具有选择优势的突变同时不可避免积累许多难以摆脱的不利突变，有利突变将随不利突变一起被淘汰，新的优良基因就不可能出现重组的意义在于，它能迅速增加群体的遗传多样性(diversity)；使有利突变与不利突变分开(separation)；通过优化组合(optimization)积累有意义的遗传信息。

　此外，DNA重组还参与许多重要的生物学过程它为DNA损伤或复制障碍提供修复机制某些生物的基因表达受DNA重组的调节　DNA重组包括同源重组（homologous recombination） 、 位 点 专 一 性 重 组（site-specific recombination）和转座重组（transposition recombination）等类型，以下分别介绍一、同源重组一、同源重组 同源重组又称一般性重组同源重组发生在DNA的同源序列之间，真核生物非姊妹染色单体的交换，姊妹染色单体的交换，细菌及某些低等真核生物的转化，细菌的转导、接合等都属于这—类型　 Holliday对遗传重组的可能机制成功提出了一个模型予以说明在分子水平上了解重组过程是在细菌的研究中加以解决的(一) Holliday模型 Robin Holliday于1964年提出一个模型，对于认识同源重组起了十分重要作用(图4-1)在这一模型中，关键步骤有四个：①两个同源染色体DNA排列整齐；②一个DNA的一条链裂断并与另一个DNA对应的链连接，形成的连接分子(joint molecule)，称为Holliday中间体(intermediate);③ 通过分支移动(branch migration)产生异源双链 (heteroduplex)DNA;④ Holliday中间体切开并修复，形成两个双链重组体DNA。

切开的方式不同，所得到的重组产物也不同如果切开的链与原来断裂的是同一条链(见Holliday模型左边的产物)，重组体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本DNA，称为片段重组体(patch recombinant)但如切开的链并非原来断裂的链(模型右边产物)，重组体异源双链区的两侧来自不同亲本DNA，称为拼接重组体(splice recombinant)Holliday模型能够较好解释同源重组现象，但也存在问题该模型认为进行重组的两个DNA分子在开始时需要在对应链相同位置上发生断裂DNA分子单链断裂是经常发生的事，但很难设想两个分子何以能在同一位置发生断裂Meselson M和Radding C对此提出了修正意见，他们认为同源DNA分子中只有一个分子发生单链断裂，随后单链入侵另一DNA分子的同源区，造成链的置换，被置换的链再切断并与最初断链连接，即形成Holliday中间体但是更多的事实表明，重组是由双链断裂所启动现在认为，同源重组是减数分裂的原因，而不是减数分裂的结果DNA分子双链断裂才能与同源分子发生链的交换，藉以将同源染色体分配到子代细胞中去因此，双链断裂启动重组，也启动了减数分裂。

 DNA的重组1.同源重组• Holliday模型图4－1　同源重组的Holliday模型两同源DNA分别以粗线和细线表示图4－2　双链断裂启动重组　DNA同源重组是一个十分精确的过程，哪怕只有一个核苷酸的差错都会造成基因失活同源重组的分子基础是链间的配对，通过碱基配对才能找到正确位置，进行链的交换当两同源DNA分子之一发生双链断裂，经核酸酶和解螺旋酶作用，产生具有3′末端的单链，它在另一DNA分子的同源区寻找互补链并与之配对相对应的链则被置换出来，与原来断裂　的链配对经修复合成和链的再连接，形成两个交叉，而不是单链交换时形成的一个交叉值得注意的是，在两交叉之间，由交换和分支移动产生的是异源双链，而由修复合成产生的是同源双链(图4-2)实验表明，两DNA分子必需具有75 bp以上的同源区才能发生同源重组，同源区小于此数值将显著降低重组率　在不同生物体内同源重组的具体过程可以有许多变化，但基本步骤大致相同同源性并不意味序列完全相同两DNA分子只要含有一段碱基序列大体类似的同源区，即使相互间略有差异，仍然可以发生重组。

同源重组是最基本的重组方式，它参与各种重要的生物学过程复制、重组和重组修复三个过程是密切相关　的，许多有关的酶和辅助因子也都是共用的同源重组也在基因的加工、整合和转化中起着重要的作用 　(二) 细菌的基因转移与重组 　 细菌可以通过多种途径进行细胞间基因转移，并通过基因重组以适应随时改变的环境这种遗传信息的流动不仅发生在种内，也发生在种间，甚至与高等动植物细胞之间也存在横向遗传传递(horizontal genetic transmission)　例如，从人体内寄生的细菌基因组中可以找到确定属于人类的基因被转移的基因称为外基因子(exogenote)，如果与内源基因组或称内基因子(endogenote)的一部分同源，就成为部分二倍体(partial diploid)，这种情况下可以发生同源重组细菌的基因转移主要有四种机制：接合(conjugation)、转化　 (transformation)、转导(transduction)和细胞融合(cell fusion)进入受体细胞(recipient cell)的外源基因通常有四种结果：降解、暂时保留、与内源基因置换和发生整合1细菌的接合作用　　细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞，称为　接合作用。

供体细胞被定义为雄性，受体细胞为雌性通过接合而转移DNA的能力是由接合质粒(conjugative plasmid)提供的，与接合功能有关的蛋白质均由接合质粒所编码能够促使染色体基因转移的接合质粒称为致育因子(fertility facter)，简称为性因子或F因子大肠杆菌F质粒(F因子)是研究得最多，也是研究得最清楚的一种接合质　粒F质粒是双链闭环的大质粒，总长约100 kb，复制起点为oriVF质粒可以在细胞内游离存在，也可以整合到宿主染色体内，因此属于附加体(episome)其与转移有关的基因(tra)占据质粒的三分之一(～33 kb)，称为转移区，包括编码F性菌毛(F pilus)、稳定接合配对、转移的起始和调节等，总共约40个基因　2细菌的遗传转化　　遗传转化(genetic transformation)是指细菌品系由于吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状的改变现象具有摄取周围环境中游离DNA分子能力的细菌细胞称为感受态细胞(competent cell)很多细菌在自然条件下就有吸收外源DNA的能力(如固氮菌、链球菌、芽孢杆菌、奈氏球菌及嗜血杆菌等)，虽然感受态　经常是瞬时的，与特定的生理状态有关。

转化过程涉及细菌染色体上10多个基因编码的功能有些细菌在自然条件下不发生转化或转化效率很低，但在实验室中可以人工促使转化例如大肠杆菌，用高浓度Ca2+处理，可诱导细胞成为感受态，重组质粒得以高效转化人工转化的机制目前还不十分清楚，可能与增加细胞通透性有关3细菌的转导　转导(transduction)是通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程转 导 有 两 种 类 型 ： 普 遍 性 转 导(generalized transduction),是指宿主基因组任意位置的DNA成为成熟噬菌体颗粒DNA的一部分而被带入受体菌；局限性转导(specialized transduction)，某些温和噬菌体在装配病毒颗粒时将宿主　染色体整合部位的DNA切割下来取代病毒DNA在上述两种类型中，转导噬菌体均为缺陷型，因为都有噬菌体基因被宿主基因所取代缺陷型噬菌体仍然将颗粒内DNA导入受体菌，前宿主的基因进入受体菌后即可与染色体DNA发生重组 4细菌的细胞融合　在有些细菌的种属中可发生由细胞质膜融合导致的基因转移和重组在实验室中，用溶菌酶除去细菌细胞壁的肽聚糖，使之成为原生质体，可人工促进原生质体的融合，由此使两菌株的DNA发生广泛的重组。

(三) 重组有关的酶已经分离并鉴定了原核生物和真核生物促进同源重组各步骤有关的酶，研究最多的还是大肠杆菌的酶在大肠杆菌中，RecA蛋白参与重组是最关键的步骤RecA有两个主要的功能：诱发SOS反应和促进DNA单链的同化(assimilation)所谓单链同化即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA　配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生当RecA与DNA单链结合时，数千RecA单体协同聚集在单链上，形成螺旋状纤丝(helical filament)RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸　　RecA蛋白相对分子质量为38000，它与单链DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体，螺旋直径10nm，碱基间距0.5nm　此复合物可以与双链DNA作用，部分解旋以便阅读碱基序列，迅速扫掠寻找与单链互补的序列互补序列一旦被找到，双链进一步被解旋以允许转换碱基配对，使单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来(图4-3)链的交换速度大约为6 bp/s，交换沿单链5′→3′方向进行，直至交换终止，在此过程中由RecA水解ATP提供反应所需能量。

图4-3RecA蛋白介导的DNA链交换模型 A:DNA链交换的侧面观: 1.RecA蛋白与单链DNA结合；2.复合物与同源双链DNA结合；3.入侵单链与双链中的互补链配对，同源链被置换出来;B:DNA链交换过程RecA蛋白的横切面  　任何部位的单链DNA都能借助RecA蛋白与同源双链DNA进行链的交换单链DNA可以由许多途径产生，RecBCD酶是产生参与重组的DNA单链主要途径该酶的亚基分别由基因recB、recC和recD编码Rec BCD酶具有三种酶活性：① 依赖于ATP的核酸外切酶活性，② 可被ATP增强的核酸内切酶活性，③ ATP依赖的解螺旋酶活性当DNA分子断裂时，它即结合　在其游离端，使DNA双链解旋并降解，解旋所需能量由ATP水解供给及至酶移动到chi位点(5′GCTGGTGG3′)，在其3′侧4～6个核苷酸处将链切开，产生具有3′末端的游离单链随后单链可参与重组各步骤大肠杆菌基因组共有1009个chi位点，分布在DNA各部位，平均5kb有一个，成为重组热点　　　由于DNA分子具有螺旋结构，在持续进行链的交换时需要两DNA分子发生旋转RecA能够介导单链绕入另一DNA分子，并水解ATP。

一旦Holliday中间体形成，即由RuvA和RuvB蛋白促进异源双链的形成RuvA蛋白能够识别Holliday联结体(junction)的交叉点，RuvA四聚体结合其上形成四方平面的构象，使得分支点易于移动，RuvA还帮助RuvB六聚体环结合在双链DNA上，位于交叉点上游　RuvB是一种解螺旋酶，通过水解ATP而推动分支移动(图4-4)RuvAB复合物的移动速度约为10～20 bp/s同源重组最后由RuvC将Holliday联结体切开，并由DNA聚合酶和DNA连接酶进行修复合成　RuvC是一种核酸内切酶，特异识别Holliday联结体并将其切开它识别不对称的四核苷酸ATTG，此序列因而成为切开Holliday联结体的热点，并决定图4-4 Ruv AB复合物结合于Holliday联结体的模型 　结果是片段重组还是拼接重组，即异源双链区两侧来自同一分子还是不同分子 相当于原核生物中与重组有关酶的对应物也已在真核生物中发现在酿酒酵母中的rad51基因与大肠杆菌recA基因同源，二者的功能有关该基因突变造成双链断裂积累，并且无法形成正常的联会复合物，但此蛋白质不能在体外与单链DNA形成纤丝，表明原核生物与真核生物的同源重组机制可能有所不同。

二、 特异位点重组 特异位点重组广泛存在于各类细胞中，起着十分特殊的作用，彼此有很大的不同它们的作用包括某些基因表达的调节，发育过程中程序性DNA重排，以及有些病毒和质粒DNA复制循环过程中发生的整合与切除等此过程往往发生在一个特定的短的(20～200 bp)DNA序列内(重组位点)，并且有特异的酶(重组酶)和辅助　因子对其识别和作用特异位点重组的结果决定于重组位点的位置和方向如果重组位点以相反方向存在于同一DNA分子上，重组结果发生倒位重组位点以相同方向存在于同一DNA分子上，重组发生切除；在不同分子上，重组发生整合(图4-5)图4-5特异位点重组的结果依赖于重组位点的位置和方向重组位点以白箭头表示A重组位点反方向位于同一DNA分子，重组结果发生倒位B重组位点同方向位于同一DNA分子，重组发生切除；位于不同分子，重组发生整合 位点专一性重组最早是在λ噬菌体的遗传学研究中发现的λDNA通过重组整合到大肠杆菌染色体的专一性位点上，转变成为原噬菌体DNA的非活性状态一般位点专一性重组都具有λ整合作用的两个基本特征：①交换是相互的和保存原 先 的 DNA， 是 典 型 的 保 守 性 重 组（conservative recombination）；②它发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列中的专一性核苷酸上，在高等生物细胞中，最重要的例子是通过一组前体序列的位点专一性重排构建多种多样的专一抗体基因。

本节简要介绍噬菌体DNA的整合与切除 λλ噬菌体的整合与切除噬菌体的整合与切除 λ噬菌体侵入大肠杆菌细胞后，面临着裂解生长还是溶源生长两种生活型的选择，其DNA在不同生活型之间的转换包括两种状态：进入溶源状态需要λDNA整合（integrate）进宿主DNA，噬菌体DNA是细菌染色体的整合部分；由溶源状态进入裂解状态需要λDNA从宿主DNA上切除（excise）下来，λDNA在宿主细菌中 以环状分子独立存在这里，整合和切除均通过细菌DNA和λDNA上特定位点之间的重组而实现这些特定位点叫附着位点（attachment site或att）细菌的附着位点称attB，由序列B、O和B’组成，噬菌体的附着位点称attP，由序列P、O和P’组成其中B、B’、P、P’的序列各不相同，而O序列是attB和attP所共有的，图4-15说明在这些位点处发生的重组反应 整合整合BOB’BOB’图图4-15 λ噬菌体的位点专一性重组噬菌体的位点专一性重组 Int 切除切除 Xis IHFPOB’attRBOP’attL原噬菌体原噬菌体DNAIntIHF细菌细菌DNA噬菌体噬菌体DNAattBattPPOP’POP’+ + 由于噬菌体DNA是环状的，在重组过程中，它以线性形式插入细菌染色体中，此时原噬菌体被重组产生的两个新att位点所固定。

所以，形成这两个新的附着位点attL（BOP’）和attR（POB’）是很重要的，这样可以使整合和切除反应不在一对相同的反应序列之间发生整合过程要求在attB和attP之间进行识别，而 切除过程则在attL和attR之间识别因此，位点专一性重组反应的定向特征取决于重组位点的识别尽管重组反应是可逆的，但反应导向则由不同条件决定，这是噬菌体生活过程的重要特征，因为它保证了整合反应不会立即被切除反应所逆转反之亦然 　三、 转 座 重 组　 转座因子(transposable element)是一种可以由染色体的一个位置转移到另外位置的遗传因子，也就是一段可以发生转座(transposition)的DNA，又称为转座子(transposon)转座的位置通常或多或少是随机的当转座子插入一个基因内时，该基因即失活，如果是重要的基因就可能导致细胞死亡因此转座必须受到控制，并且频率都很低转座子对基因组而言是一个不稳定因素，它可导致宿主序列删除、倒位或易位，并且其在基因组中成为“可移动的同源区”位于不同位点的两个拷贝转座子之间可以发生交互重组，从而造成基因组不同形式的重排有些转座子与基因组的关系犹如寄生，它们的功能只是为了自身的扩增与繁衍，因此被称为是自私的DNA(selfish DNA)。

 早在20世纪40年代，美国遗传学家McClintock B在研究玉米的遗传因子时发现，某些基因活性受到一些能在不同染色体间转移的控制因子(controlling element)所决定这一发现与当时传统的遗传学观点相抵触，因而不被学术界所普遍接受直到60年代后期，美国青年细菌学家Shapiro J在大肠杆菌中发现一种由插入序列 (insertion sequence,IS)所引起的多效突变，之后又在不同实验室发现一系列可转移的抗药性转座子，才重新引起人们重视1983年McClintock被授予诺贝尔生理学与医学奖，距离她公布玉米控制因子的时间已有32年之久 (一) 细菌的转座因子　细菌的转座因子有两类：一类为插入序列(IS)，是简单的转座子，除转座所需基因外不携带任何标记基因，它的存在只能借助插入位点有关基因的失活来判断，或者通过分子杂交和测序来检测另一类是复杂转座子(Tn)，除转座酶(transposase)基因外还携带各种标记基因，因而易于检测其存在1插入序列插入序列是最小的转座因子所有插入序列的两端都有反向重复(inverted repeats)，反向重复为转座酶识别所需，通常重复序列长度为15～25 bp。

重复序列有时只是类似，并非完全相同IS的大小范围是768bp-7.5Kb，但大部分小于2.5Kb每种IS元件具有不同的序列，但有共同的组织形式，即由一个中央区域和两侧不完全反向的末端重复序列构成这些末端重复序列的大小、序列、相关性是不同的；中央区域可能含有1～3个开放阅读框，其中一个编码转座酶，没有和转座功能无关的基因图 4-19是插入序列IS1的结构，IS1含有转座酶基因，负责IS1的移动，该基因的两端为24 pb的反向重复序列 图图4-19 插入序列插入序列IS 1的结构的结构IRIR2424bpbp2424bpbp720720bpbpIS1转座酶基因 2转座子转座子除编码转座功能有关的基因外还携带抗性或其他标记基因转座子按其结构 又 分 为 两 类 ： 一 类 为 组 合 因 子(composite element)，由个别模件组合而成，通常包括两个插入序列作为两臂，中间为标记基因另一类为复合因子(complex element)， 含有转座酶基因、解离酶(resolvase)基因以及标记基因，两端为反向重复，无插入序列组合型的转座子很可能是通过一个插入序列的拷贝插在附近区域而形成的。

两个插入序列中间夹着一段序列即可构成一个转座单位每个插入序列两端为反向重复，因此，无论两插入序列处于正向还是反向位置，作为转座单位其两端均有可被转座酶识别的反向重复序列如果两个插入序列正好位于抗性基因两侧，该转座单位携带的性状对宿主细胞是有利的，因而具有选择优势组合转座子的两个插入序列以正向或反向(更常见)位于两端，它们的序列可以不完全相同，有时只有一个插入序列具有转座活性，另一个已在多次传代中失去活性组合转座子的结构如下： 图图4-20 复合转座子的结构复合转座子的结构Tn1681Tn1681IS1IS1552552bpbpIRIRIRIR大肠杆菌热稳定毒素I基因 3转座过程与效应 转座酶能够识别转座子的末端反向重复序列并且在其3′端切开，同时在靶部位交错切开单链，它的5′突出末端与转座子的3′末端连接，形成Shapiro中间体不同种类转座子形成与靶序列连接中间体的过程大致相同；随后步骤各不一样按其转座过程是否发生复制，可分为非复制转座(nonreplicative transposition)和复制转座(replicative transposition)两类非复制转座又称为保留性转座(conservative transposition)，转座子从原来位置上切除下来转入新的位置，其两条链均被保留。

复制转座则在形成靶部位与转座子连接中间体后即进行复制通过复制使原来位置与新的靶部位各有一个转座子，其一条链是原有的，另一条链是新合成的复制转座使给体与受体分子连在一起，成为共整合体(cointegrate)，因此下一步必须通过重组将二者拆开非复制转座与复制转座过程见图4-10 图4-10非复制转座与复制转座的基本过程  所有转座因子都有在基因组中增加其拷贝数的能力此过程可以借助两种方式来完成：一是通过转座过程的复制(复制转座)；另一是从染色体已完成复制的部位转到尚未复制的部位，然后随着染色体而复制非复制转座的转座因子只能借后一种方式来扩增共整合体含有两个拷贝的转座子，故可通过同源重组将连接的两部分分开但是借助Rec A蛋白拆分效率较低转座子编码的解离酶可在解离区(res)进行重组，可极大提高解离效率解离酶是一种重组酶，它所催化DNA链的断开和再连接并不需要供给能量当它在res位点断开两条链时，解离酶以共价键连在键的5′末端 转座因子首先因其可导致突变而被认识它插入基因后，使基因突变失活，这是转座作用最直接的效应当转座因子自发插入细菌的操纵子时，即可阻止它所在基因的转录和翻译；并且由于转座因子带有终止子，它的插入将影响到操纵子中其后基因的表达，因而表现出极性(polarity)，也即方向性。

由此构成的负突变只有在插入因子被切除后才能恢复转座因子的存在，往往会引起宿主染色体DNA重组，造成染色体断裂、重复、缺失、倒位及易位等，是基因突变和重排的重要原因转座因子也可通过干扰宿主基因与其调控元件之间的关系或转座因子本身的作用而影响邻近基因的表达，从而改变宿主的表型  (二) 真核生物的转座因子 最早发现能转移的遗传因子是玉米转座子，它对染色体基因有不稳定的诱变效应，因而影响某些遗传性状，故称为控制因子其后发现真核生物广泛存在各种转座因子真核生物的转座因子与原核生物转座因子十分相似；转座依赖于转座酶，转座因子的两端有被转座酶识别的反向重复序列，转座的靶位点是随机的，靶位点交错切开，插入转座因子后经修复形成两侧正向重复序列但是二者在结构和性质上也有一些差别原核生物的转录和翻译几乎是同时进行的，真核生物由于核结构的存在而使此两过程在空间上和时间都被分隔开了因此，真核生物细胞内只要存在转座酶，任何序列片段具有该酶识别的反向重复末端均可发生转移，而无需由被转移序列自身编码这些酶这就可以说明，为什么真核生物的转座因子家族中只保留少数拷贝具有编码转座酶基因的活性，而多数拷贝中发生程度不同的删除，失去转座酶基因活性，但保留了两端的反向重复序列。

原核生物的转座酶主要作用于产生它的转座因子，表现出顺式显性(cis dominance)，真核生物则无此特性，这也是二者最明显的差别  Hello!。