柱层析试验方法.docx

硅胶柱层析硅胶柱层析原理硅胶层析法的分离原理是根据物质在硅胶上的吸附力不同而得到分离， 一般悄 况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程 即是吸 附、解吸、再吸附、再解吸过程硅胶柱层析流动相极性小的用乙酸乙酯 / 石油醴系统;极性较大的用甲醇/氯仿系统;极性大的用甲醇 / 水/ 正丁醇 / 醋酸系统 ;拖尾可以加入少量氨水或冰醋酸硅胶柱层析惯用方法1. 称量 200-300 L1 硅胶，称 30-70 倍于上样量;如果极难分，也可以用100倍 量的硅胶Ho干硅胶的视密度在0.4左右，所以要称40g硅胶，用烧杯M 100ml也可 以2. 搅成匀浆加入干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌如果洗脱剂是石油0迷/乙酸乙酯/丙酮体系，就用石油口迷拌；如果洗脱剂是氯仿/醇体系，就用氯仿 拌如果不能搅成匀浆，说明溶剂中含水量太大，尤其是乙酸乙酯 / 丙酮，如果不与水配伍走分配色谱的话，必须预先用无水硫酸钠久置干燥氯仿用无水氯化钙干燥，以 除去1%的醇如果样品对酸敬感，不能用氯仿体系过柱3. 装柱将柱底用棉花塞紧，不必用海沙，加入约 1/3体积石油SB （氯仿），装上蓄液球， 打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内。

随着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内，用石油0迷（氯仿）将其冲入柱中4. 压实沉降完成后，加入更多的石油日迷，用双联球或气泵加压，宜至流速恒定柱床约被压缩至 9/10 体积 无论走常压柱或加压柱， 都应进行这一步 ,可使分 离度提高很 多，且可以避免过柱时由于柱床萎缩产生开裂5. 上样干法湿法都可以海沙是没必要的上样后，加入一些洗脱剂，再将一团脱脂棉塞至接近硅胶表面然后就可以放心地加入大量洗脱剂，而不会冲坏硅胶表面6. 过柱和收集柱层析实际上是在扩散和分离之间的权衡太低的洗脱强度并不好，推荐用梯度洗脱收集的例子：10mg上样M,lg硅胶H, 0.5ml收一铺分；1- 2g上样量 ,50g 硅胶 （ 200-300 |zl ） , 20-50ml 收一憎分7. 检测 要更多地使用专用喷显剂，如果仅用紫外灯，会损失较多产品，紫外的 灵 敬度一般比喷显剂底1-2 个数量级8. 送谱收集的产品旋干,在送谱前通常需要重结晶如果样品太少或为液体, 可过一小凝胶柱，作为送谱前的最后纯化手段可除去氢谱 1. 5ppm 左右所谓的“硅胶”峰柱层析实验介绍1?装柱子：装柱子（添硅胶）时，有两种方法 :即湿法装柱和干法装柱，二者各有优劣。

不论干法还是湿法， 硅胶 （固定相） 的上表面一定要平整， 并且硅胶 （固定相） 的高度一般为 15cm 左右，太短了可能分离效果不好，太长了也会由于扩散或拖尾导致分离效果不好湿法装柱是先把硅胶用适当的溶剂拌匀后，再填入柱子中，然后再加庄用淋洗剂“走柱子”，本法最大的优点是一般柱子装的比较结实，没有气泡干法装柱则是直接往柱子里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后再填入硅胶至合适高度,最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱 子装的很结实2. 上样：上样也有干法和湿法之分；干法就是把待分离的样品用少量溶剂溶解后，再加入少量硅胶,拌匀后再旋去溶剂如此得到的粉末再小心加到柱子的顶层干法上样较麻烦，但可以保证样品 层很平整湿法上样就是用少量溶剂（最好就是展开剂，如果展开剂的溶解度不好，则可以 用一极性较大的溶剂，但必须少量）将样品溶解后，再用胶头滴管转移得到的溶液，沿着层析柱内壁均匀加入然后用少量溶剂洗涤后再加入湿法较方便，熟手一般采用此法3. 走柱子：接着是用淋洗剂“走柱子”，一般淋洗剂是采用TLC分析（后有详细介绍）得到 的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂通常上面加压，下面再用油泵抽，这样可以加快速度。

干法装柱较方便，但最大的缺陷在于〃走柱子”时，曲于溶剂和硅胶之间的吸附放热（可以用手摸柱子明显感觉到），容易产生气泡，这一点在使用低沸点的淋洗剂时如乙0迷、二氯中烷更为明显虽然产生的气泡在加压的情况下不易察觉，但是一旦撤去压力，如在上样、加溶剂等操作的时候，气泡就会释放出来，严重时，整个柱子变花，样品不可能平整地通过，当然也就谈不上分离了解决的办法是：第一、硅胶一定要结实 ;第二、 一定要用较多的溶剂 "走柱子 " ，一定要到柱子的下端不再发烫， 恢复到 室温后再撤去压力也有介绍在硅胶的最上层填上一小层石英砂,防止添加溶剂的时候，使得样品 层不再整齐但个人感觉是如果小心上样，添加溶剂，则没有这个必要关于柱层析的经验-1柱层析和TLC是有机化学工作者必须下苦功夫的两项实验技术这两项技术掌握与否，对于提高实验的效率至关重要常见的例子是：在柱层析时， 由于层析柱中的硅胶填料装得不均匀（没有填严实）， 使得柱子在淋洗过程中就因为出现太多气泡变花,导致分离效果不好更常见的例子是一层析柱虽然装得不错，但是由于淋洗剂选择不恰当 ,结果导 致儿十毫克产品 ,用了儿百毫升淋洗剂都还没有完全分离分离同样的东西，熟手可能只需要半个小时，而一个层析技术不过关的人可能 半天都不能得到纯品。

山此可见 ,这两项技术掌握与否，对于提高工作效率，减轻工 作量 , 减少有机溶剂的使用，从而对身心健康和环境保护都有明显的作用柱层析关键在于柱子是否装好和淋洗剂是否选择恰当而淋洗剂的选择则是 通过TLC确定这里要指出的一点是：TLC的作用除了跟踪反应进程、检测试剂和原料纯度外;列一个重要的用途就是为柱层析选择适当的淋洗剂 上样完毕后， 接着 即用淋洗剂淋洗淋洗剂一般采用TLC分析得到的展开剂的比例再稀释一倍后的溶剂由于层析柱和薄板的不同，即使两者使用的硅胶都相同，但是在把TLC分析得到的展开剂用在柱层析时，也显得极性偏大，所以要稀释一倍，但乂不能稀释太多，否则成了靠扩散作用来分离，效果也不会好关于柱层析和TLC 实验的经验-2常说的过柱子应该叫柱层析分离,也叫柱色谱我们常用的是以硅胶或氧化铝 作固定相的吸附柱 III 于柱分的经验成分太多,所以下面我就儿年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助1. 柱子可以分为 :加压 / 常压 /减压压力可以增加淋洗剂的流动速度， 减少产品收集的时间 ,但是会减低柱子的塔板数所以其他条件相同的时候,常压柱是效率最高的，但是时间也最长比如天然化合物的分离，一个柱子儿个月也是有的。

减压柱能够减少硅胶的使用量,感觉能够节省一半甚至更多，但是山于大量的 空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深用的感情，但是自从尝试了加压后，就儿乎再也没 动过减压 的念头了加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）特别是在容易分解的样品的分离中适用压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的2. 关于柱子的尺寸应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高柱子粗了，上样后样品的 原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度试想 如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性 的溶剂慢慢冲了而如果样品层只有0. 5 厘米 ,那么各组分就比较容易得到完全分离了当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了 （有些不环保的说， 不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费） 。

现在见到的柱子径高比一般在1:5、10,书中写硅胶M是样品M的30八40倍，具 体的选择要具体分析如果所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf 在 0. 2'0. 4,杂质相差 0. 1 以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如 200 毫克的样品，用 2cmX20cm的柱子）；如果相差不到 0. 1, 就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径, 比如用 3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等附注：f—流速（rate of flow ）o溶剂从原点渗透到距离a（一般在20-30厘米时测定） 的时候， 如果位于原点的物质从原点向前移动到 b, 那么 b/a 的值 （ 0. 0— 1. 0） 就是这种物质的 Rf 值3. 关于无水无氧柱适用于对氧、水敬感，易分解的产品，可以湿柱,也可以干柱不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次，因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分解 ,毕竟要分离的是敬感的东东，小心不为过也是因为分离的东西比较墩感，所以 接收瓶一定要用可密封的，遵循schlenk 操作（附注 :Schlenk line, 中文一般叫做 “希莱克技术”它主是用来提供惰性环境以及真空条件的 ,要是用玻璃仪器组成 的,所以实验玻璃器材比较严格。

比如装置用的活塞使用聚四氟乙烯高真空式活塞, 接头用 0 环接口等等该装置的主干是 Schlenk line 玻璃管，一般有两根，一根用 于提供真空条件，另一根提供惰性条件在其下边连接的是反应烧瓶等 Schlenk line 玻璃管连接到 pre-trap 以及main-trap 玻璃装置 pre-trap 以及 ma in-trap 放置在氮气瓶内，用于冷凝挥发性溶剂的至于是加压、常压、减压,随需而定因为是schlenk 操作，所以点板是个问题，如果样品是显色的，恭喜了，不用点 板，直接看柱子上的色带就行了如果样品无色，只好准备儿十个schlenk 瓶，一瓶 一瓶的点，不过儿次之后就知道样品在哪，也就可以省些了像我以前过一根无水无 氧柱，需要六个schlenk, 现在只一个就能把所要的全收集到无水无氧柱中用的比较多的是用氧化铝作固定相裸露在外，很容易是样品分解，特别是金属有机化合物和含磷化合物而氧化铝可以 做成碱性、中性和酸性的，选择余地比较大，但是比硅胶要贵些听说有个方法，就 是用石英做柱 子,然后用HF254做固定相，这样在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了，没有验证过哪位做过可以提出来大家参详参详。

4. 关于湿法、干法上样湿法省事，一般用淋洗剂溶解样品，也可以用二氯甲烷、乙酸乙酯等，但溶剂越少越好，不然溶剂就成了淋洗剂了很多样品在上柱前是粘乎乎的,一般没关系可是有的上样后在硅胶上乂会析出，这一般都是比较大量的样品才会出现，是因为硅胶对样品的吸附饱和，而样品本身乂是比较好的固体才会发生，这就应该先重结晶，得到大部分的产品后再柱分，如果不能重结晶，那就不管它了，直接过就是了，样品随着淋洗剂流动会溶解的有些样品溶解性差，能溶解的溶剂乂不能上柱（比如DMF,DMSO^,会随着溶剂 一起走，显色是一个很长的脱尾），这时就必须用干法上柱了样品和硅胶的量有一 种说 法是 1:1, 我觉得是越少越好,但是要保证在旋干后，不能看到明显的固体颗粒 （那说明有的样品没有吸附在硅胶上）5. 溶剂的选择当然是最便宜，最安全,最环保的了所以大多选用石油醴、乙酸乙酯文献 中有写用正己烷的 - 太贵了，除非特别需要不要用不然银子哗哗的，流的比淋洗剂还快，不过因为极性很小，有时还是非它不可乙0迷也可以用，但。