二氢嘧啶脱氢酶活性及5.docx

二氢嘧啶脱氢酶活性及5-氟尿嘧啶活性代谢产物测定及其临床应用■山东大学齐鲁医院临床药理研究所李平利张蕊郭瑞臣5-氟尿嘧啶（5-FU）及其前体药物卡培他滨临床常用于乳腺癌、结直肠癌及头颈癌等多种肿 瘤的治疗5-FU进入机体后，80%以上经肝脏二氢嘧啶脱氢酶（DPD）代谢并转化为氟代0 -丙氨酸（FBAL）, FBAL的代谢产物为氟乙酸（Fluoroacetate）和氟代柠檬酸（F-citrate）,是 引起5-FU心脏及神经毒性的主要活性物质部分未经DPD代谢的5-FU在体内转化为具有 生物活性的FUTP和FdUTP，通过干扰肿瘤细胞RNA或DNA的生物合成发挥抗肿瘤作用， 或转化为FdUMP，与胸苷酸合成酶（TS）、5，10-亚甲基四氢叶酸（CH2THF）形成稳定的三 联复合物，抑制TS正常功能，干扰DNA合成，发挥DNA介导的细胞毒性作用（如图所示） DPD基因（DPYD）存在多态性，不同个体间DPD活性差异较大，甚至部分或完全缺失DPD 部分或完全缺失个体， 5-FU 常规剂量可导致清除率降低，发生 5-FU 相关毒性，如粘膜炎、 粒细胞减少症、神经性病变，甚至死亡而DPD高表达个体，则造成5-FU耐受，常规剂量 难以达到理想治疗效果。

由于DPYD基因存在多个突变位点，或可能存在未知位点，或某些 位点功能活性的研究尚不完全，导致已知 DPYD 基因突变与 DPD 表型缺乏一致性因此， DPD活性测定对于5-FU个体化治疗更具重要意义其他参与5-FU体内生物转化的尿苷磷酸 化酶、乳清酸磷酸核糖转移酶、胸苷磷酸化酶等的基因型及活性不同个体间也不完全相同， 使产生活性代谢产物FUTP、FdUTP、FdUMP的量存在差异而FUTP、FdUTP及FdUMP是杀 伤肿瘤细胞的直接作用形式，故测定其细胞内浓度可更直接地揭示或预测5-FU的疗效或毒 副作用因此，直接或间接测定DPD活性及5-FU活性代谢产物水平有助于制订、调整、修 饰5-FU的给药方案，提高疗效，降低毒副作用，并进一步评价常规5-FU浓度测定的优势和 局限性，明确 5-FU 发挥药效或产生毒副作用的机制1. DPD活性测定DPD活性测定包括表型测定（Phenotype）、基因型测定（Genotype）、蛋白表达及mRNA水 平测定1.1 DPD 表型测定 表型指在环境影响下基因型所发生的机体的物理表现和可见性状，不同表型药物代谢酶的催 化代谢活性大小, 可通过测定其底物的代谢率断定。

底物可以是外源性探针药物，如异烟肼、 氨苯砜、咖啡因等可用于测定N-乙酰基转移酶表型测定，非治疗目的，一次性服用；也可 以是治疗药物，如5-氟尿嘧啶，以原形与代谢物比值表示相关酶活性的强弱DPD分布于人体多个组织、器官，但主要存在于肝脏，参与80%以上5-FU的肝脏代谢测 定血浆或尿液二氢尿嘧啶（UH2）、尿嘧啶（U）、二氢胸腺嘧啶（THY2）、胸腺嘧啶（THY）、 二氢氟尿嘧啶（5-FUH2）、氟尿嘧啶（5-FU）浓度，计算 UH2/U、THY2/THY、5-FUH2/5-FU 值可间接反映DPD活性Ben Fredj等采用高效液相色谱-紫外方法测定9例接受5-FU/亚叶酸钙化疗的晚期结直肠癌患 者血浆UH2与U峰面积，计算所得UH2/U值范围为0.07〜3.12该比值与相应5-FU血浆半 衰期呈负指数相关，与患者 5-FU 毒性相关 Serdar 等采用 LC-MS/MS 测定 45 例接受 5-FU 治疗患者PBMCs中5-FUH2和5-FU浓度，计算得5-FUH2/5-FU值为21.9±3.72, 2例DPD缺 失患者分别为1.26和1.61，说明DPD活性缺失可使5-FU的清除率严重降低。

Van Kuilenburg AB等以放射性[4-14C]THY为底物，采用反相高效液相色谱方法检测THY及其 降解产物THY2浓度，以每毫克蛋白每小时代谢生成的THY2 nmol数表示DPD活性结果显 示，2例5-FU治疗出现严重毒性反应的癌症患者PBMCs DPD活性分别为3.2nmol・mg-1・h-1 和4.2nmol・mg-1・h-1,低于健康志愿者平均DPD活性水平其中1例患者治疗后康复期 DPD活性恢复到正常水平（8.6nmol・mg-1・h-1）进一步研究显示，44例接受5-FU/亚叶 酸钙化疗患者PBMCs中DPD活性在4.2〜16.0nmol・mg-1 ・h-1范围内呈高斯分布，较低DPD 活性与中性粒细胞减少症显著相关，但与胃肠道反应、流感样症状、手足综合征等毒副反应 无相关性Buchel等采用LC-MS/MS方法测定10例结直肠癌患者接受5-FU治疗前内源性血浆U、UH2 及接受5-FU治疗2h后外源性5-FU、5-FUH2浓度结果显示,U和UH2浓度范围分别为（0.07〜 2.6 ）和（0.81 〜1.77） |J M，UH2/U 值为 3.7 〜15.4； 5-FU 和 5-FUH2 浓度范围为（1.4 〜6.7） 和（9.1〜25.8） J M。

由于DPD可能存在饱和状态，接受5-FU治疗后，即体内有5-FU存在 时，U和UH2浓度高于接受5-FU治疗前，即体内不存在5-FU时Sistonen等认为，多数个 体，接受 5-FU 治疗前的 UH2/U 值为 DPD 非饱和状态时的活性，不能准确反映 DPD 活性变 化，而5-FU治疗期间所得UH2/U值更准确因此，接受5-FU治疗前给予一定量DPD底物 （如U）,所得UH2/U值可更准确评估DPD活性，并准确预测5-FU相关性毒性另外，由于5-FU可被DPD代谢为FBAL，FBAL水平也可一定程度上反映DPD活性有报道 采用RP-HPLC法测定体外细胞内经DPD分解的5-FU代谢物FBAL浓度，或采用LC-MS/MS法 测定职业暴露于5-FU人员尿液FBAL浓度，可用于监测、评价医护人员暴露于5-FU的风险， 也可用于 DPD 活性测定采用探针药物间接测定 DPD 活性，包括其他药物代谢酶，快速、简便，易于推广，但探针 药物须代谢机制清楚，代谢途径单一；排除其他疾病、年龄因素影响；原形和代谢物浓度测 定方法应灵敏专一1.2 DPYD 基因型测定已知DPYD基因存在30多种单核苷酸多态性及缺失突变，包括DPYD*2A、DPYD*13等，可 造成 DPD 活性降低或缺乏。

不同的基因位点突变对 DPD 活性影响不同，因此，明确 DPYD 基因型与活性之间的相关性可用于指导5-FU剂量方案调整DPYD*2A突变导致第14位外显子缺失，造成DPD活性降低甚至丧失一项Meta分析结果 表明，DPYD*2A突变与5-FU相关毒性反应（三3级）密切相关（OR 5.42，P<0.001）,须将 5-FU或卡培他滨初始给药剂量降至标准剂量的50%，以降低DPYD*2A突变携带者发生严重 毒性反应的风险Henricks等认为，DPYD*2A纯合突变个体，不建议给予5-FU类药物杂 合突变个体DPD活性降低50%，c.2846A>T纯合突变个体降低50%，杂合突变个体降低25%， 可采用荧光原位杂交、基因测序等技术分析DPYD基因多态性，根据患者基因型预测DPD活 性及 DPD 代谢 5-FU 的能力，高效、简便，可用于 5-FU 的个体化治疗但由于体内处置过 程的复杂性和未知基因突变位点存在的可能性，以及已发现突变位点与酶活相关性有待证实 通过基因型预测酶活性尚有一定局限性1.3 DPD蛋白及mRNA水平测定DPD mRNA水平与DPD活性密切相关，肿瘤组织或细胞DPD活性可预测5-FU的治疗效应和 毒性效应。

因此，也可采用免疫组化或逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法测定肿瘤组织 DPD蛋白表达，预测DPD活性Kim等测定184名胃切除术并替吉奥（S-1）辅助化疗的胃 癌患者肿瘤组织DPD蛋白表达及mRNA水平，单变量或多变量分析表明，肿瘤组织DPD蛋 白表达量或mRNA水平较低患者，5年无病生存期（DFS）差，更易发生非血液学毒性（羽 级）反应但肿瘤组织DPD mRNA高表达患者，对以5-FU为基础的化疗方案则产生较差的 治疗效果提示，DPD不仅影响5-FU及含5-FU药物治疗方案的治疗效应和毒性作用，还影 响决定疗效的活性产物生成2. 5-FU 活性代谢产物测定 由于细胞内活性代谢物含量较低，细胞转运蛋白外排作用的程度难以确定，代谢物与内源性 核苷酸结构高度类似存在干扰，较难准确测定但FUTP、FdUTP、FdUMP确为5-FU细胞内 发挥抗肿瘤作用的活性物质，细胞内水平直接反映到达作用部位的量，对于指导5-FU剂量 方案调整，阐述耐受机制，有不可替代的作用因此，应建立准确、可行、实用的体内 FUTP、 FdUTP、 FdUMP 水平测定方法Carli 等采用固相提取法，对极性化合物有较长保留时间的 AtlantisC18 色谱柱，流动相为甲 酸铵（5mM, pH4） /甲醇/水（5/5/90, v/v）,等离子梯度洗脱，三重四级杆质谱检测器定 量测定MCF-7细胞内5-FdUMP （ng/“g蛋白）。

结果显示，5-FU孵育后30min内，细胞内 5-FdUMP的量呈线性增加操作简便，可用于生物样本5-FdUMP检测Derissen 等建立了 UPLC-MS/MS 方法测定接受 5-FU 治疗患者 PBMCs 中 FUTP、FdUTP、FdUMP 含量采集患者16ml外周血，提取白细胞，甲醇裂解后取上清液进样3例口服卡培他滨 及5例接受FOLFOX6化疗方案治疗的癌症患者PBMCs中FUTP、FdUTP、FdUMP测定结果显 示，卡培他滨给药后0〜8h内，测得FUTP最低浓度为1.84nM，但未测出FdUTP和FdUMP 同样，静脉注射5-FU患者，测得FUTP最低浓度为178nM，FdUMP最低浓度为3.39nM，但 未测出FdUTP提示该方法特异、灵敏，但需进一步优化，或扩大样本，提高研究方法的适 用性，以实现对生物样本FUTP、FdUMP和FdUTP的定量检测以及临床实用价值的评价3. 展望DPD 酶在 5-FU 化疗过程中发挥着重要的作用，掌握其生理病理特点、作用规律和影响因素 有助于提高5-FU的疗效，降低其毒副作用虽然DPYD基因多态性检测已被推荐用于预测 5-FU 类化疗药物的毒性及敏感性， 5-FU 浓度测定也被常规用于治疗药物监测，但作为补充， DPD酶活性测定可更全面反映由未知基因突变或非基因因素造成的DPD活性改变，并作为 制定、调整、修饰 5-FU 治疗方案的依据，提高 5-FU 治疗的有效性和安全性。

此外，尽管 DPD 活性研究已较为深入，但由于研究者的角度不同，如样本来源，体内体外 研究，采用的方法不同，如色谱法、光谱法、免疫法等，或样本量的局限性，导致 DPD 活 性缺乏统一的界值，即低于界值患者更大可能出现高风险毒性反应，从而需要规范设计、采 用先进技术、进行更大样本量的研究，以确定DPD活性界值5-FU 活性代谢产物 FUTP、 FdUTP、 FdUMP 可直接反映其发挥疗效、产生毒副作用及耐受的 机制，有助于进一步揭示 5-FU 代谢动力学特征，有助于 5-FU 的个体化治疗，有助于验证、 评价 5-FU 常规治疗监测的可靠性及可行性，因此，排除内源性核苷酸的干扰，建立灵敏、 可靠、实用、可行的细胞内ng甚至pg水平FUTP、FdUTP、FdUMP活性代谢物定量测定方 法，可最大限度地指导 5-FU 的临床合理使用。