天花粉蛋白对荷瘤小鼠抑瘤作用的实验研究.doc

1天花粉蛋白对荷瘤小鼠抑瘤作用的实验 研究作者：张艳琼， 黄利鸣， 吴江锋【摘要】 目的通过建立荷 U14 小鼠宫颈癌模型，从个体水平初步探索天花粉蛋白（TCS）对荷瘤小鼠体内抗肿瘤活性方法建立荷 U14 小鼠宫颈癌模型，TCS 治疗，检测抑瘤率、脾指数、流式细胞术分析 T 细胞亚群结果 TCS 治疗组，脾指数明显高于阴性对照组，C 较阴性对照组、CTX 组明显减少（P0.05）；与正常组比较无显著性差异TCS 组的 C/C 较阴性对照组、正常组明显增大（P0.05）；与CTX 组比较无显著性差异结论在体内，当 TCS 的剂量为 0.2 mg/kg 时，具有一定的免疫调节和增强体液免疫功能作用 【关键词】 天花粉蛋白 荷瘤鼠 抑瘤作用Abstract：Objective To study the anti-tumor effect of trichosanthin(TCS) in U14 mice.MethodsAfter setting up the animal model of U14, the subset of the T cells was analyzed by the tumor inhibitory rate, the index of spleen and FCM. ResultsAfter treatment with TCS, the index of spleen was increased obviously compared with the negative group, the C decreased obviously compared with the negative and CTX groups（P0.05）, but had no significant difference as compared with the normal group. The C/C in TCS group was increased obviously compared with the negative and normal groups（P0.05）, but had no siguificant difference as compared with the CTX group.ConclusionThe TCS can regulate immunity and increase the humoral immunity in vivo when its dose is 0.2 mg/kg.Key words：Trichosanthin; Mice with tumor; Effect of tumor- inhibition人子宫颈癌是导致妇女死亡的一种常见恶性肿瘤。

天花粉蛋白（trichosanthin，TCS)是从葫芦科植物栝楼 trichosanthin kirilouii Maxim 的块根中提取的一种单链核糖体失活蛋白(ribosome-inactivating protein，RIP)体外大量实验2证实其具有抗宫颈癌的作用［1，2］，为进一步证实 TCS 是否具有体内抗宫颈癌和调节机体免疫的活性，我们进行了 TCS 对荷小鼠宫颈磷癌 U14 裸鼠体内实验研究1 材料1.1 材料 TCS 购自上海金山制药厂（1.2mg/ml）；环磷酰胺购自江苏恒瑞医药股份有限公司； RPMI-1640 培养基购自 Gibcol 公司；PE 标记 C 抗体购自eBioscience 公司；FITC 标记 C 抗体购自 eBioscience 公司；倒置显微镜和多功能显微镜及图像分析系统购自德国 Leica 公司；EPICSXL-4 型流式细胞仪购自Beckman coulter 公司U14 肿瘤细胞株由三峡大学医学院免疫重点实验室提供1.2 动物 6～8 周龄近交系 Balb/c 小鼠 32 只，体质量 18～20 g，雌性，购自武汉大学实验动物中心2 方法2.1 TCS 对实体瘤的抑制作用复苏 U14 细胞株，昆明小鼠腹腔中反复传代，第3 代后 5～7 d，取小鼠腹水，用无菌生理盐水调整细胞浓度为 2×107/ml。

常规消毒后，取 0.2 ml 细胞悬液接种于 Balb/c 小鼠右侧腋窝皮下接种后的小鼠随机分 3组：TCS 实验组、阴性和阳性对照组，每组 8 只TCS 实验组：用生理盐水稀释TCS 注射液，药物浓度为 0.2 mg/kg，0.2 ml/只，给药 1 次/d，连续给药 10 次阳性对照组：环磷酰胺（cytoxan, CTX），30 mg/kg阴性对照组给予等体积的生理盐水另设正常组 8 只，不进行任何处理2.2 组织取材和称重第 11 天称小鼠体质量眼球取血，置于加有抗凝剂的试管内处死小鼠，取出肿瘤组织、脾脏，称瘤重、脾重，计算抑瘤率(inhibition rate, 3IR)计算脾指数，公式为：脾指数(SI)=脾脏重量(S)/体质量(W)(g/g)2.3 流式细胞术分析 T 细胞亚群将血液中分别加入 PE 标记的 C、FITC 标记的 C 单克隆抗体各 20 μl，混匀，于室温下避光作用 15～30 min每个试管内加入溶血剂 2 ml，颠倒混匀后放暗处 10 min，离心，用 PBS 洗 1 次，加 1%甲醛 PBS液 0.6 ml，固定 10～30 min，经流式细胞仪检测每管中 C，C 细胞百分比。

2.4 统计学处理实验数据以±s 表示，采用 SPSS10.0 软件进行分析（t 检验） 3 结果3.1 小鼠一般情况的观察小鼠皮下接种 U14 瘤细胞 5 d 内外观无明显的变化，活泼，大小便、饮食正常；接种癌细胞 5～7 d 后可触及皮下肿块，成瘤率 100%，生理盐水组后期肿瘤生长迅速3.2 TCS 对荷瘤小鼠体质量、脾重和瘤重的影响结果见表 1表 1 荷瘤小鼠的体质量、脾指数、瘤重和抑瘤率（略）3.3 流式细胞仪检测 T 细胞亚群的结果实验结果表明：①阳性对照组的 C 较其它各组均明显增高，差异有显著性（P0.05）；阴性对照组的 C 较其它组均明显减少，与 TCS 组有差别（P0.05），与正常对照组比较统计学上无差异；②TCS 组的 C 较阴性对照组、阳性对照组明显减少（P0.05）；与正常组比较无显著性差异；③TCS 组的 C/ C 较阴性对照组、正常组明显增大（P0.05）；与阳性对照组比较无显著性差异；其它各组之间无显著性差异结果见表 2表 2 天花粉蛋白对荷瘤小鼠 T 细胞的影响（略）44 讨论TCS 具有广泛地抗肿瘤作用，现陆续有报道 TCS 具有体内抗实验性肿瘤作用。

孙健等［3］在研究 TCS 抑制肝癌肺转移时，应用 LCI-D20 模型观察荷瘤裸鼠肺转移发现 TCS 组肺转移率为 41.7%(5/12)，而对照组高达 100%(20/20)为了进一步提高 TCS 的疗效，靶向治疗受到重视，将重组免疫毒素 EGF-TCS 重组蛋白用于荷人肝癌 BEL-7402 裸鼠体内的实验研究，可以有效地抑制实体瘤的生长［4］众多体外实验也证实，TCS 能引起多种宫颈癌细胞株凋亡［1，2］而对其是否具有体内抑制宫颈癌生长的作用，尚未见报道为了证实其疗效，我们通过建立荷 U14小鼠动物模型，检测了 TCS 的体内抗宫颈癌效果小鼠子宫颈鳞癌 U14 是应用专用线结经甲基胆蒽浸泡后, 穿进幼鼠宫颈诱发成瘤后，移植于远交系 KM 小鼠皮下形成的一个异位子宫颈癌, 能在小鼠皮下形成实体瘤(成瘤率达 100%)，因此建立 U14 动物模型是研究宫颈癌的理想模型［5］我们的研究表明 TCS 的抑瘤率是 11.2%，采用重组免疫毒素 EGF-TCS 进行靶向治疗是否可以进一步提高抑瘤率值得进一步探讨TCS 通过不同途径影响机体的细胞免疫和体液免疫TCS 可使正常人外周血C 和 CD+20T 细胞百分比升高, CT 细胞百分比下降, 从而使 C/C 比值增大［6］。

TCS 能诱导 Th2 细胞中 IL-4 和 IL-10 的表达，但抑制 Th1 细胞中 IL-2 和 IFN-gamma 的表达［7］我们初步探索了剂量为 0.2 mg/kg 的 TCS 在机体免疫应答中的作用，TCS 可以引起小鼠外周血中 C 细胞显著增加, C 明显减少，C/ C 比值升高，该结果与 TCS 对人体外周血的影响吻合［6］，因此，TCS 具有一定的免疫调节和增强体液免疫功能的作用5【参考文献】［1］Wang P, Yan H, Li JC.CREB-mediated Bcl-2 expression in trichosanthin- induced Hela cell apoptosis［J］.Biochem Biophys Res Commun,2007, 363(1):101.［2］王艳华，黄利鸣.OPCML、DAPK 基因甲基化与宫颈癌 CasKi 细胞凋亡相关性的研究［J］.中国药理学通报，2008，24 (4) : 543.［3］孙健，吴志全，薛琼,等.天花粉蛋白抑制肝细胞癌肺转移的实验研究［J］.中华肝胆外科杂志，2005，11（4）：253.［4］杨海文, 李咏梅, 罗仁.重组免疫毒素 EGF-TCS 对荷瘤小鼠抗肿瘤效果的实验研究［J］.南方医科大学学报，2007，27(10)：1535.［5］李秀真, 朱万孚, 曹卉，等.乳酸杆菌诱导小鼠宫颈鳞癌 U14 细胞凋亡的动物实验［J］.中华微生物学和免疫学杂志，2004，24（4）：268.［6］周广宇, 毕黎琦, 高申,等.天花粉蛋白对淋巴细胞亚群的免疫调节作用［J］.吉林大学学报( 医学版)，2003，29（3）：289.［7］Zhou X, Yang N, Lu L, et al. Up-regulation of IL-10 expression in dendritic cells is involved in Trichosanthin-induced immunosuppression［J］.. Immunol Lett, 2007,110(1):74.。