11生物化学教程蛋白质的性质教学案例.ppt

第五节 蛋白质的重要性质（一）蛋白质的两性解离和等电点（pI）（二）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀（三）蛋白质的变性（四）蛋白质的水解（五）蛋白质的颜色反应（一）蛋白质的两性解离和等电点（pI）、两性解离、蛋白质的等电点（pI）、电泳、两性游离 NH3 + Pr COOH NH3+ Pr COO- NH3 Pr COO- OH-OH-H+H+阳离子阴离子兼性离子（pHPI） （pH=PI） （pHPI）几种蛋白质的等电点（pI）蛋白质名称 来源 pI 血清蛋白 人血 4.64肌球蛋白 肌肉 7.0 胃蛋白酶 猪胃 2.83.0胰蛋白酶 胰液 5.0卵清蛋白 鸡蛋 4.84.9白明胶 动物皮 4.8、电泳 带电颗粒向与其电荷相反的电极方向移动 意义：用于蛋白质的分离、纯化鉴定和分子量的测定 血清蛋白电泳图谱：+-清蛋白12球蛋白电泳 蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化电泳方法：v自由界面电泳v区带电泳纸电泳凝胶电泳圆盘电泳平板电泳（二）蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀1、蛋白质是高分子化合物，分子量多在1万100万之间2、球状蛋白质的颗粒大小达1100 nm范围，故蛋白质有胶体性质。

蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体3、蛋白质分子大，不能透过半透膜4、蛋白质在一定的溶剂中，经超速离心，可发生沉降蛋白质的胶体性质n颗粒大小：在1100nm之间因此溶于水，成为亲水胶体 n稳定亲水胶体的因素： 水化膜 表面电荷 不通透性：半透膜 透析的原理： 透析n 将蛋白质溶液(不纯)放入透析袋中，放在流水中（纯水），让低分子杂质（如盐类）透过半透膜扩散入水内，蛋白质则留在袋中，分离纯化蛋白质半透膜阻留pr分子，而让小的溶质分子和水通过，以达到除去蛋白质溶液中小分子（盐、低分子酸等）沉降作用n1、沉降概念： 蛋白质溶液经高速离心分离时，由于比重关系，蛋白质分子趋于下沉，离心管底部的蛋白质浓度增高n2、沉降速率： 在离心时，蛋白质分子在单位时间t（以秒计）内下沉的距离x（以cm计）以v表示 v= dx/dt沉降作用n1、沉降概念：n2、沉降速率： v= dx/dtn3、沉降常数（沉降系数，S） 单位引力场沉降分子下沉的速率 S= v /2x v：沉降速率（dx/dt）可以从实验测得离心机转子每秒钟的角速度，以弧度/秒计即2 转子每秒钟的转速） x：蛋白质界面中点与转子中心之间的距离（以cm计）。

Svedberg单位的定义：n单位引力场沉降分子下沉的速率n取 1 10-13秒为一个Svedberg单位n例：牛血清清蛋白的沉降常数为:4.410-13用Svedberg单位则为: 4.4 S原核细胞核糖体的沉降常数为:7010-13用Svedberg单位则为: 70 S蛋白质的沉淀1、概念：蛋白质分子发生凝聚，从溶液中析出的现象2、蛋白质水溶液是一种比较稳定的亲水胶体 稳定因素：水化膜 电荷 破坏稳定因素，就可使蛋白质颗粒凝聚而沉淀3、沉淀方法： 盐析法有机溶剂沉淀重金属盐沉淀条件: pHpI (Pr- M+)某些酸类沉淀条件： pHpI ( Pr+ X-) 加热变性沉淀盐析法n加高浓度中性盐使蛋白质沉淀析出nNaCl、 （NH4）2SO4、NaSO4等n破坏蛋白质胶体周围的水化膜，中和了蛋白质分子的电荷，使蛋白质沉淀而析出n分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出n分离制备蛋白质的常用方法有机溶剂沉淀n有机溶剂：乙醇、丙酮等n破坏蛋白质颗粒表面的水化膜npH=pI时，可加速蛋白质沉淀n低温（04 ）重金属盐沉淀反应条件: pHpI NH3+Pr COO- NH2Pr COO-OH-M+ NH2Pr COO-M+不溶性蛋白盐氯化高汞、硝酸银、醋酸铅、三氯化铁等。

M+： 重金属离子某些酸类沉淀反应条件: pHpI NH3+Pr COO- NH3+Pr COOHH+X- NH3+X-Pr COOH不溶性蛋白盐苦味酸、单宁酸、钨酸、鞣酸、三氯乙酸等X- ：酸根一些常见的蛋白质沉淀剂n、盐：破坏水膜，中和电荷盐溶、盐析的概念n、有机溶剂：破坏水膜n、重金属盐：n、一些酸类物质：与蛋白质生成不溶性盐如：苦味酸、单宁酸、4、应用：n蛋白质的分离制备n灭菌技术n生物样品的分析、杂质除去等都要涉及此反应三）蛋白质的变性1、概念： 蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构（次级键，特别是氢键）被破坏，从而改变其理化性质，并失去生物活性，这称为蛋白质的变性蛋白质的变性（三）蛋白质的变性2、变性因素： 物理因素：加热、高压、振荡或搅拌、紫外线照射、超声波及射线等 化学因素：强酸、强碱、重金属离子和尿素、乙醇、丙醇等有机溶剂3、变性实质：维系蛋白质空间结构的次级键断裂，其特定的空间结构被改变或破坏n二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变n蛋白质变性的主要标志是生物功能的丧失介电常数n介电常数是两种电荷被真空隔绝时的电势与被介质隔绝时的电势的比值。

n表示介质影响相反电荷间吸力的数值4、变性蛋白质的特征：理化性质的改变： 溶解度降低； 粘度上升； 易被蛋白酶水解； 不能结晶生物学性质的改变 生物活性表失（酶失去其催化活性、激素失去其调节性、抗体失去其生物活性、细菌蛋白失去其致病性一些与食品相关的蛋白质的热变性温度/ 蛋白质质热变热变 性温度 蛋白质质热变热变 性温度牛血清白蛋白血红红蛋白鸡鸡蛋白蛋白肌红红蛋白 65 67 76 79-乳清蛋白-乳球蛋白 大豆球蛋白 燕麦球蛋白 83 83 92 108n蛋白质的变性程度较轻时，去除变性因素后，蛋白质恢复原有空间构象和生物活性的现象称为复性复性(renaturation)去除尿素，-巯基乙醇天然状态， -SH 氧化形成-S-S-，有催化活性非折叠状态，无活性，-S-S-被还原成-SHSHSHSHSHSHSHSHSH尿素，-巯基乙醇天然状态，有催化活性牛胰核糖核酸酶、实际应用 消毒灭菌中毒的急救临床检验保存和制备生物制剂有利于蛋白食物的消化吸收蛋白质的凝固n变性蛋白质分子互相凝聚或互相穿插缠绕（结）在一起的现象n蒸蛋（四）蛋白质的水解蛋白质蛋白胨 小肽二肽氨基酸 检查蛋白质水解程度的方法：n用Van Slyke 测自由氨基的方法，当水解完全时，自由氨基N趋于恒定。

n用检查双缩脲反应的消失（水解完全后就不再呈阳性反应） 与亚硝酸的反应 HNO2 亚硝酸RCHCOOHNH2 氨基酸RCHCOOH +N2 +H2O OH 羟基酸（五）蛋白质的颜色反应n作为蛋白质的定性和定量试验n作为分析氨基酸的显色反应n作为检验蛋白质水解是否完全1、双缩脲反应C=ONH2NH2C=ONH2NH2加热180 C=ONH2NHC=ONH2+ NH3双缩脲尿素1、双缩脲反应C=ONH2NHC=ONH2+ CuSO4双缩脲紫红色化合物1、双缩脲反应加热稀碱溶液 CuSO4 蛋白质或多肽紫红色 氨基酸不出现此反应当蛋白质溶液中蛋白质的水解不断加强时，氨基酸浓度上升，其双缩脲呈色的深度就逐渐下降，因此双缩脲反应可检测蛋白质水解程度2、与水合茚三酮的反应OOOHOH2+沸腾蓝紫色化合物蛋白质溶液3、蛋白质黄色反应蛋白质溶液 + 浓HNO3白色沉淀加热黄色沉淀含Phe、Tyr、Try的蛋白质所特有的反应4、米伦氏反应 米伦试剂：硝酸汞 亚硝酸汞 硝酸 亚硝酸的混合液 蛋白质溶液加入米伦试剂后即产生白色沉淀，加热后沉淀变成红色 酪氨酸及含有酪氨酸的蛋白质都有此反应5、乙醛酸反应 在蛋白质溶液中加入乙醛酸，并沿试管壁慢慢注入浓硫酸，在两液层之间出现紫色环。

色氨酸及含有色氨酸的蛋白质有此反应6、酚试剂（福林试剂）反应 蛋白质一般都含有酪氨酸，而酪氨酸中的酚基能将福林试剂中的磷钼酸及钨钼酸还原成蓝色化合物（即钼蓝和钨蓝的化合物） 定量测定蛋白质含量蛋白质的颜色反应反应应名称试试 剂剂 颜颜 色反应应有关的基团团有此反应应的蛋白质质或氨基酸双缩脲缩脲反应应加NaCl及少量稀CuSO4紫色粉红红色2个以上肽键肽键所有的蛋白质质米伦伦反应应加HgNO3Hg（NO3）2HNO3共热热红红色酚基酪氨酸黄色反应应浓浓HNO3及NH3黄色桔色苯基酪氨酸苯丙氨酸蛋白质的颜色反应反应应名称试试 剂剂 颜颜 色反应应有关的基团团有此反应应的蛋白质质或氨基酸乙醛醛酸反应应乙醛醛酸试剂试剂及浓浓H2SO4紫色吲哚吲哚 基色氨酸茚茚三酮酮反应应茚茚三酮酮蓝蓝色自由氨基及羧羧基-氨基酸酚试剂试剂 反应应碱性CuSO4及磷钨钨酸-钼钼酸蓝蓝色酚基、吲哚吲哚 基酪氨酸色氨酸-萘萘酚-次氯氯酸盐盐反应应-萘萘酚次氯氯酸钠钠红红色胍基精氨酸蛋白质的紫外吸收n波长：280nmn引起紫外吸收的因素：主要是酪氨酸和色氨酸(Tyr ,Trp)的共轭双键n可用于蛋白质的定量分析色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的紫外吸收光谱蛋白质的别构作用n含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个蛋白质分子构象、性质和功能发生改变的作用称蛋白质的别构作用。

n因别构而产生的效应称别构效应 正别构效应 负别构效应酶的别构效应别构酶 某些物质能与酶分子上的非催化部位特异地结合，使酶蛋白分子构象发生改变，从而改变酶的活性，这种现象称为酶的别构调节具有这种调节作用的酶，称为别构酶 第六节 蛋白质的提取、分离纯化和测定n1、生物材料的选择：n2、细胞的破碎：n3、提取：n4、过滤：n5、分离：n6、提纯：n7、测定：细胞的破碎：n机械法：n高速组织捣碎法n玻璃匀浆器n研磨（加砂）n化学及生物化学法：n自溶n溶菌酶处理法n表面活性剂处理法n物理法：n反复冻融法n冷热交替法n超声波处理法n加压破碎法十二烷基磺酸钠氯化十二烷基吡啶脱氧胆酸钠细胞破碎n如目的蛋白在细胞内，需要进行细胞破碎，使蛋白释放出来n动物细胞可用匀浆器、组织捣碎机、超声波等方法破碎n植物可用石英砂研磨或纤维素酶处理n微生物的细胞壁是一个大分子，破碎较难有超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等方法蛋白质的分离纯化和鉴定n提取n分离n纯化n鉴定提取n 提取通常是指用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程经过处理和破细胞的原材料中的有效成分，可用缓冲液，或稀酸、稀碱、有机溶剂（如丙酮、乙醇）等溶液提取。

有时还可以用蒸馏水提取理想的提取溶剂应具备下述条件：n对有效成分溶解度大，破坏作用小；n对杂质不溶解或溶解度小；n来源广泛、价格低廉、操作安全等n一般用缓冲液保持pH可溶蛋白常用稀盐提取，如0.1Mol/L NaCl脂蛋白可用有机溶剂提取，不溶蛋白用稀碱处理提取的原则是少量多次要注意防止植物细胞液泡中的代谢物改变pH，可加入碱中和n为防止酚类氧化可加5mMol/L维生素Cn加入SH基的保护剂，防其被氧化n加碘乙酸可抑制蛋白酶活力，防止蛋白被水解n加入EDTA，防重金属对蛋白质的破坏n低温操作 提取 搅拌n 搅拌能促使欲提取物与提取液的接触，并能增加溶解度但是，一般宜采用温和的搅拌方法，速度太快时容易产生泡沫，导致某些酶类变性失活粗提 n主要目的是除去糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩常用以下方法：n沉淀法n分级法：常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白 n除盐和浓缩 分离n用适当方法使蛋白质从提取液中分离出来n分离方法：n等电点法n盐析法n有机溶剂沉淀法n核酸沉淀剂：MnCl2、硫酸鱼精蛋白、链霉素、核酸酶等n蛋白沉淀剂：醋酸铅、单宁酸、SDS等，也可除多糖，沉淀后应迅速盐析除去沉淀剂，以免目的蛋白变性。

n选择变性：用加热、调节pH或变性剂选择性地变性杂蛋白如提取胰蛋白酶或细胞色素C时，因其稳定性高，可用2.5三氯乙酸处理，使杂蛋白变性沉淀沉淀法分级法n常用盐析或有机溶剂分级沉淀蛋白 n盐析后样品中含大量盐类，用透析除去也可用分子筛，如Saphadex G25层析除盐如样品过。