鳖甲抗肝纤维化活性组分的研究..doc

鳖甲抗肝纤维化活性组分的研究作者：唐尹萍，胡春玲，施嬪妮，高建蓉，姚航平， 刘叙文【摘要】 目的 筛选鳖甲抗肝纤维化的活性组分方法 传代培养的 IISC-T6与鳖甲Bj61~Bj68共同培养72h后，采用MTT比色法测定各浓度 组HSC-T6的增殖情况结果Bj61~Bj65和Bj68对HSC-T6细胞无抑制作 用，而Bj66和Bj67有较强的抑制作用结论Bj66和Bj67为鳖甲的活性 组分关键词】 鳖甲；活性组分;MTT比色法[Abstract] Objective To screen lhe active constituent from Carapax Trionycis・ Methods Secondary culture HSC-T6 in vitro, which was co-cultrued with Bj61-Bj68 , then MTT assay was applied to detect the i mpac ts of Tri onyx sinensis at different concentrations on HSC-T6・ Results Bj61 - Bj65 and Bj68 had no inhibitory effect on IISC - T6 cells, but Bj66 and Bj67 had a stronger inhibitory effect on HSC - T6 cells・ Conclusion Bj66 and Bj67 is the active constituent from Carapax Trionycis・[Key words] Carapax Trionycis ;active constituent;MTT鳖甲为鳖科动物鳖Trionyx sinensis Wiegmann的背甲，具有滋 阴潜阳、软坚散结、退热除蒸的功效[1]。

鳖甲常用于治疗慢性肝病、预 防肝硬化[2-4],是治疗肝纤维化疾患的常用中药，但鳖甲的活性成分鲜 见报道本实验依据活性筛选的思路，在高建荣等［5］确定分子量小于 6000的多肽为鳖甲抗肝纤维化活性部位的基础上，采用葡聚糖凝胶G-25、 葡聚糖凝胶G-15进一步分离为8个组分，再用MTT比色法进一步筛选鳖 甲抗肝纤维化的活性组分，为后续的筛选活性单体奠定了基础1材料与方法1. 1材料1. 1. 1对象 大鼠肝星状细胞系（HSC-T6） 1浙江大学附属第一医院 肝病研究所提供1.1.2试验药物及主耍试剂（1）试验药物：鳖甲（醋制品）由浙江衢 化医院提供，粉碎后过80冃筛2）细胞培养试剂：胰蛋白酶（trypsin）. 非必需氨基酸（NEAA）. Iligh-DMEM培养基，GIBCO产品；胎牛血清，武汉 三利生物技术有限公司产品;青霉素、链霉素，华北制药股份公司产品；二 氧化碳（C02）,武汉市明辉气体科技有限公司3）细胞增殖用试剂：二甲 基亚砚（DMS0）、曝哮蓝（MTT）,武汉凌飞科技有限公司4）葡聚糖凝 胶G-25、葡聚糖凝胶G-15:北京慧得易公司1. 1.3仪器C02培养箱，口本SANYO公司产品;全自动酶标仪，美 国Bio-Rad公司产品;倒置相差显微镜，日本Olympus公司产品；洁净工作 台，上海博迅医疗设备厂产詁。

1. 2试验方法1.2.1鳖甲透析物干燥粉末的制备 精密称取鳖甲粉末100g,加 200ml双蒸水超声提取20min,抽滤，残渣加水100ml超声lOrnin,抽滤，合并滤液，冷冻干燥得冻干粉再用少量水将冻干粉溶解，装于透析膜内, 用100ml水于4C透析5h,透析2次，合并膜外溶液，冷冻干燥最后得 螫甲干燥粉末为淡黄色絮状粉末，即为螫甲的抗肝纤维化活性肽类物质 [5] (M<6000)o1.2.2鳖甲抗肝纤维化活性部位不同组分的分离称取50g葡聚糖 凝胶G-25 (Sephadex G-25),加入过量双蒸水，加热溶胀约2h,放置冷却 至室温，装柱取0. 3653g醋鳖甲透析物干燥粉末，用双蒸镭水8讷溶解, 加入色谱柱上端，用蒸憎水洗脱，收集流分，每份10ml,共收集8个流分, 即将鳖甲抗肝纤维化活性肽类物质分离为8个部位，分别记录为Bjl〜Bj8, 其中Bj4.Bj6和Bj7为活性部位[6]再称取70g葡聚糖凝胶G-15 (Sephadex G-15),加入过量双蒸水，加热溶胀约2h,放置冷却至室温，装柱取0. 4012g Bj6样品，用双蒸憾水5ml溶解，加入色谱柱上端，用蒸憾水洗脱，收集 流分，每份10ml,共收集8个流分，即将鳖甲抗肝纤维化活性部位Bj6分 离为8个组分。

提取分离流程见图1图1提取分离流程1.2.3 HSC的培养及传代 将传代的HSC-T6培养 于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100mg/ml链霉素和1% NEAA的 High-DMEM培养液中，置于37C> 5%C02、饱和湿度的细胞培养箱中培养; 在倒置显微镜下观察细胞长到亚单层或细胞密度约80%〜90%时，是 HSC-T6传代的标志；吸弃培养基，加入0.25%胰蛋白酶1〜2nd, 37C消 化2〜弘in,待细胞回缩，瓶壁有少量细胞脱落，即用含血清培养基终止; 收集细胞悬液于50ml消毒离心管中，1700r/niin, 4C离心7min,弃去上清液，加入含10%胎牛血清的DMEM用吸管反复吹打、分散细胞，取细胞 悬液光镜下计数，完全培养基调整细胞浓度,以1 X105/ml传代度接种于96孔培养板，每孔加100U1,细胞贴壁长满孔底12h后，换用 5%FCS的DMEM培养基,培养12h后，分别加入高、中、低剂量Bj61~Bj68 （以含5%FCS的DMEM培养基倍比稀释成16、8、4mg/ml,用0. 45 u in滤 膜过滤），4孔重复，另设空白对照组（含5%FCS的DMEM培养基）。

培养72h 后,去培养基（翻板），每孔加20 U 1 MTT溶液孵育4h,每孔加入DMSO 100Ml,在微型混合器上振荡2min, 10mi n后于酶•标仪上0D490值，再按下 式计算抑制率：抑制率二（1-药物组0D值 对照组0D值）X 100%1.3统计学方法 实验结果以xs表示应用单因素方差分析， P<O. 05表示差异有显著性2试验结果传代培养的大鼠肝星状细胞系HSC-T6与不同浓度Bj61~Bj68样品 共同培养72h后，采用MTT比色法测定各浓度HSC-T6增殖情况与空白 对照组相比，样品BJ66. Bj67在各浓度对HSC-T6细胞均有抑制作用，其 中高、中浓度差异均有显著性（P<O. 05）结果见表lo表1鳖甲Bj61〜 BJ68对IISC-T6细胞增殖的抑制作用3讨论肝纤维化是慢性肝病发展至肝硬化甚至原发性肝细胞癌的必经阶 段，是各种慢性肝病的共同病理学基础［7］在肝纤维化形成的过程中， 肝星状细胞（HSC）的“持久化”激活和增殖是中心环节［8］;阻抑激活的HSC 增殖和诱导促进IISC凋亡是防治肝纤维化的重要措施［9］ o在临床应用上,鳖甲为治疗肝纤维化的传统中药，但鳖甲含有蛋白质、多肽、氨基酸、多糖等物质，化学成分复杂，因而鳖甲的抗肝纤维化活性单体少见报道。

本 文在前期实验的基础上，采用葡聚糖凝胶G-15对鳖甲的活性部位Bj6进 行分离,得到Bj61〜Bj68共8个组分，再采用MTT比色法确定Bj66、Bj67 具有明显抑制人鼠肝星状细胞系HSC-T6的增殖作用，即为鳖甲的抗肝纤 维化活性组分;该活性组分的化学成分比Bj6少许多，就可以通过制备高 效液相色谱分离得到单体，为下一步筛选活性单体打下坚实的慕础参考文献】1国家药典委员会•中国药典，一部•北京:化学工业出版社，2005, 266.2姜宏伟•单味鳖甲治疗肝炎肝硬化30例•临床医学,2007 ,(6) : 93-94.3杨杰，谢春娇•鳖甲汤治疗乙肝肝硬化腹水38例•实用中医内科杂 志，2005, 19(4) :362.4王英凯，王丹，唐彤宇•鳖甲为主的中药治疗肝纤维化的实验室和 临床研究•临床肝胆病杂志,2002, 18(4):253-254.5高建蓉，张赤志，邵志华，等•鳖甲对肝星状细胞增殖影响的研究. 实用医学杂志,2007, 23(11) :16-18.6高建蓉，刘叙文，李昌煜，等•鳖甲抗肝纤维化活性物质的筛选与 分离鉴定•中华肝脏病杂志，2010, 18(5) :341-347.7徐克成，江石湖•消化病现代治疗•上海：上海科技教育出版社， 2001, 486;493.8 Friedman SL・ Molecula/r regulation of hepatic fibrosis, an275(4): 2247-2250.an9 Fredman SL, Lalazar A, Wong L, et al. HSC-T6 cells,i minor taliped rat hepatic st el la tecel 1 line. Hep 且 to logy , 1997 26(4Pt2) :338A.。