琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量.doc

琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量二．材料与方法1 材料RNA 样品2 仪器、用具 电泳仪、电泳槽、凝胶样品梳、微波炉、移液器等3 试剂⑴1XTAE电泳缓冲液⑵ 溴化乙锭溶液(EB)［有毒，小心操作］(3) 琼脂糖(4) 6x加样缓冲液4 方法(1) 选择孔径大小适合的点样梳，垂直架在胶版的一端，使点样梳底部离电泳槽水平面的距 离为 0.5-1mm2) 称取0.25g琼脂糖，加入25ml IxTAE电泳缓冲液中，微波炉加热使琼脂糖溶解均匀3) 于50ml的离心管中加入1.25“l EB (10mg/ml)(4) 待凝胶冷却至50°C左右，将凝胶倒入50ml离心管中)(5) 将离心管中的凝胶溶液轻轻倒入电泳凝胶板上，除去气泡)(6) 待凝胶凝固后，小心取出点样梳)(7) 在电泳槽中加入 1xTAE 电泳缓冲液，将胶板放入电泳槽中(点样孔一端靠近电泳槽的 负极)，使电泳缓冲液没过胶面)(8) 待测样品中加入1/6体积的6x上样缓冲液，混合后，移液枪点样，记录样品点样顺序 及样量)(9) 连接电泳槽与电泳仪之间的电源线，正极为红色，负极为黑色)(10) 开启电源，开始电泳，最高电压不超过5V/cm)(11) 当指示剂跑过胶板的 2/3，可终止电泳；切断电源后，将电泳凝胶块放在凝胶成像仪 中观察，拍照)电泳检测：1%琼脂糖凝胶电泳，检测RNA完整性，观察18s、28s条带)这里，RNA电泳要特别注意胶的浓度和质量。

首先，浓度不宜过高，1%-1.2%为宜) 其次，每次配胶不宜过多，最好现用现配，但是一次配100ml, 3-5次可用完也可溶胶时 一定要溶解彻底并且均匀，否则倒胶时产生气泡，影响电泳效果晾胶时，要以稍高于体温 为佳，温度过高会导致胶体过软，给点样造成困难)倒胶时，注意胶的厚度，原则是宁厚5 薄，胶板过薄点样孔盛放不下点样量，样品溢出导致弥散胶板如果很厚，一般要晾置20 分钟以上，否则胶体晾置不彻底，拔掉梳子会破坏点样孔，同时胶体密度也会变得不均一, 影响电泳效果)对于RNA电泳，电泳液的要求也很高，最好每次都使用新的电泳液，因为RNA极易 降解，所以不宜与其他电泳液混用同时，要注意电泳液的配制，为lxTAE，如果电泳液 配制有误则会导致电压不稳，或者电压无法上升最后，保证了电泳液和胶体质量以后，就可以进行点样了点样时，要注意点样量， 以3“为宜，与loading-buffer混匀后要用移液枪将其完全吸取，完全点入点样孔内，不要 有溢出，同时点样时力度不宜过大，否则会使枪头捅漏胶板，样品流入电泳液，导致电泳失 败电泳条件，由于RNA自身易降解的特点，建议使用高电压，短时间电泳方式，130-140V 电压，10-15分钟即可。

电泳时间长短会影响带型的相对位置，所以不能单纯靠对比Marker 来断定。