微生物实验报告：测定细菌生长曲线.doc

测定细菌生长曲线一、 实验目的1． 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时；2． 学习液体培养基的配制以及接种方法；3． 反复练习无菌操作技术；4． 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同；5． 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法；二、 实验原理将一定量的菌种接种在液体培养基内，在一定的条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性，如以细菌活菌数的对数做纵坐标，以培养时间做横坐标，可绘成一条曲线，称为生长曲线单细胞微生物发酵具有4个阶段，即调整期〔迟滞期〕、对数期〔生长旺盛期〕、平衡期〔稳定期〕、死亡期〔衰亡期〕生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的的全过程动态不同微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的测定微生物生长曲线的方法很多，有血细胞计数法，平板菌落计数法，称重法和比浊法本实验才用比浊法，由于细胞悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的菌液的浓度将所测得的光密度值〔OD600〕与对应的培养时间做图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。

注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌和死菌，因此所测生长曲线的衰亡期不明显从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示，其计算公式为：G＝〔t2-t1〕/[(lgW1-lgW2)/lg2]式中t2和t1为所取对数期两点的时间，W1和W2分别为对应时间测得的细胞含量或OD三、 实验器材 大肠杆菌，枯草杆菌菌液及平板； 培养基(100mL/250mL三角瓶×10瓶/大组):牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基； 取液器(5000ul, 1000ul 各一支)，无菌1000ul吸头假设干，无菌5000ul吸头假设干，比色皿10个及共用参比杯一个，培养箱3台，722s分光光度计；四、 实验步骤1． 活化菌种 将细菌接种到牛肉膏蛋白胨葡萄糖三角瓶培养基中，37℃振荡培养18h，另外准备单菌落平板各1块；2． 接种6人大组分为3个小组，按表1接种编号接入菌种培养条件——0——放置在实验台上做对照第1小组1大肠杆菌菌液37 ℃ 200rpm23.0ml大肠杆菌菌液37 ℃ 200rpm35.0ml大肠杆菌菌液37 ℃ 200rpm第2小组4一个大肠杆菌菌落37 ℃ 200rpm5大肠杆菌菌液37 ℃ 110rpm6大肠杆菌菌液30 ℃ 200rpm第3小组7枯草杆菌菌液37 ℃ 200rpm8枯草杆菌菌液30 ℃ 200rpm9枯草杆菌菌液37 ℃ 110rpm3． 培养并测量每培养一小时取样一次：取500ul培养液到2000ul蒸馏水中，以蒸馏水为对照，测OD600，固定参比杯，不要调动波长旋钮；固定一台分光光度计; 零小时也要测。

全班同时取样,同时开始振荡, 取样期间时间不算培养开始时，测0号瓶pH实验结束后，测1－9号瓶pH五、 结果OD600记录结果见表2表2. 发酵过程OD600测量值划线结果表示明显错误，作图时弃去；绿色表示用于计算代时　发酵时间/小时0.00 0.98 2.17 2.73 3.31 3.95 4.55 5.67 6.78 7.93 8.98 10.07 编号OD600〔除0小时外均是测量值减基准值〕10.032 -0.030 0.156 0.233 0.301 0.249 0.309 0.312 0.309 0.315 0.317 0.317 20.123 -0.031 0.163 0.217 0.284 0.226 0.285 0.267 0.277 0.284 0.287 0.274 30.141 -0.008 0.191 0.253 0.280 0.225 0.163 0.213 0.292 0.297 0.286 0.256 4-0.021 -0.026 -0.022 -0.031 -0.029 -0.088 -0.020 0.044 0.224 0.344 0.371 0.365 5-0.012 0.029 0.184 0.224 0.255 0.203 0.269 0.259 0.250 0.239 0.254 0.206 6-0.013 0.003 0.089 0.173 0.258 0.270 0.317 0.409 0.415 0.415 0.383 0.401 70.002 -0.040 -0.039 0.153 0.344 0.021 0.062 0.194 0.242 0.297 0.372 0.427 8-0.007 -0.027 -0.034 0.166 0.318 -0.023 -0.008 0.052 0.107 0.199 0.277 0.337 9-0.008 -0.034 -0.018 0.189 0.397 -0.020 0.069 0.245 0.288 0.285 0.372 0.412 对各组数据做生长曲线图，可得图1。

a．b．c．d．e．f．g．h．i．图1.生长曲线a～i图分别绘出1～9号培养瓶的OD600－发酵时间曲线，每幅图上方小标题表示该图的培养条件g～i组2.7和3.3小时数据明显错误，未绘入图2．pH 对照组初始pH＝7.0， 用实验室的两种试纸：6.4~8.0，4.0~5.0，各实验组均未测出准确pH值看来pH都处在5.0~6.4之间，精确值未知3．代时计算根据表1中的红色数字对应的时间及OD600，我们用公式： G＝〔t1-t2〕/[(lgW1-lgW2)/lg2]来计算各瓶的代时计算结果见表2t1/ht2/hW1W2代时G/min123456789 理论上，大肠杆菌代时为37min，枯草杆菌代时为25min，我们的计算结果还与之相去甚远原因主要是培养条件不行，不是连续发酵，没有营养补充，而且细菌生长时经常被我们“打搅〞，不能一直保持高速生长状态而且我们都是用原始数据点进行计算的，可能会有较大偏差可以利用软件对生长曲线进行拟合，得到平滑的S型曲线再计算可惜我没有相关软件，只好凑活用Excel 六、 讨论 从上面的实验结果可以看出，不同菌种、不同温度、不同转速条件下，发酵的生长曲线和代时有很大差异。

下面我们分别对这些影响因素进行讨论1． 温度我们选取培养瓶1号和6号、7号和8号分别做比照，在同一张图内做生长曲线(图2)不同温度下大肠杆菌的生长曲线不同温度下枯草杆菌的生长曲线图2.温度对于生长曲线的影响上图菌种为大肠杆菌，下列图菌种为枯草杆菌除温度外，其余条件均一样由图可以看出，大肠杆菌在37℃条件下调整期较短，迅速进入对数期在30℃条件下，调整期、对数期均有明显增长，稳定期到来较晚，且维持在一个较高的水平上可以认为37℃更利于大肠杆菌的生长，30℃条件下细菌需要更长的时间来适应温度但是比拟代时发现，37℃的代时要长于30℃，这与生长曲线数据矛盾，可能是OD600测量中的微小误差积累起来所致，下面将讨论而在枯草杆菌中，37℃的调整期较短，代时也短于30℃说明37℃更利于枯草杆菌生长2． 转速我们选取培养瓶1号和5号、7号和9号分别做比照，在同一张图内做生长曲线(图3)不同转速下大肠杆菌的生长曲线不同转速下枯草杆菌的生长曲线图3.转速对于生长曲线的影响上图菌种为大肠杆菌，下列图菌种为枯草杆菌除转速外，其余条件均一样 从图3看出，转速对于调整期和对数期没有太大影响，但是高转速带来的高溶氧可以显著缩短大肠杆菌的代时。

大肠杆菌是兼性厌氧，在高溶氧条件下生长较快，在低溶氧条件下也可生长，只是速度较慢而已对于枯草杆菌，从生长曲线、代时上看都没有显著改变但是枯草杆菌是需氧菌，理论上讲应该高转速有利生长可能是因为振荡作用缺乏以使溶氧增加到影响枯草杆菌生长的阙值，或是低转速已经足够提供其快速生长所需氧气3． 细菌种类 我们选取培养瓶1号和7号、5号和9号、6号和8号分别做比照，在同一张图内做生长曲线(图4)图4.各个培养条件下大肠杆菌和枯草杆菌的生长曲线比照温度、转速表于每幅图上方 由图4可以看出，在各个培养条件下，枯草杆菌的调整期均明显长于大肠杆菌，而对数期也要长于大肠杆菌，代时较短说明大肠杆菌能够很快地适应发酵环境，快速生长，而枯草杆菌调整能力较弱，但生长能力较强4． 菌种状态我们选取培养瓶1号和4号，在同一张图内做生长曲线(图5)图5.大肠杆菌不同菌种状态的生长曲线比照培养条件为37℃，200rpm从图5可以明显看出，固体菌种的调整期约为5个小时，远长于液体菌种〔约为1个小时〕，可能原因是固体菌种需要一定时间来分散到培养基中，以免局部过浓发生种内竞争但是可能是因为固体菌种里菌数较多，生长起来速度非常快，其代时很短，而且对数期较长，如果继续发酵的话可能会到达很高的稳定期平台。

5． 菌种数量 我们选取培养瓶1号、2号和3号，在同一张图内做生长曲线(图6)图6.大肠杆菌不同菌种数量的生长曲线比照培养条件为37℃，200rpm 从图6的3条曲线可以看出，不同接种量对生长曲线没有什么影响，而代时也没有显。