实验七细胞骨架的观察(考马斯亮兰r250染植物细胞的微丝).jsp.ppt

实验七 细胞骨架的观察,考马斯亮兰R250染植物细胞的微丝,一、实验目的,掌握观察植物细胞内微丝的方法 了解观察动物细胞内微丝的方法二、实验原理,细胞骨架是指细胞质中纵横交错的纤维网格结构，安组成成分和形态结构的不同可分为微管、微丝和中间纤维它们对细胞形态的维持、细胞的生长、运动、分裂、分化和物质运输等起重要作用 光学显微镜下细胞骨架的形态学观察多用1％Triton X-100处理细胞，可使细胞膜溶解，而细胞骨架系统的蛋白质被保存，再用考马斯亮兰R250染色，使得细胞质中细胞骨架得以清晰可见细胞骨架,三、材料和试剂,材料：新鲜洋葱鳞茎 器材：光学显微镜、天平、吸管、载玻片、盖玻片、烧杯、镊子、剪刀、表面皿、染色缸 试剂： 0.2mol/L磷酸盐缓冲液（ pH6.8）， 1％ Triton X-100（用M-缓冲液配制）， M-缓冲液， 3%戊二醛（用0.2mol/L磷酸盐缓冲液配制）， 0.2％考马斯亮兰R250,M-缓冲液,咪唑 KCl MgCl2·6H2O EGTA（乙二醇双（α-氨基乙基）醚四乙酸） EDTA（乙二胺四乙酸） 巯基乙醇 甘油（丙三醇） 蒸馏水,四、实验步骤,1. 取洋葱近中轴鳞片内表皮和靠近外层的鳞茎内表皮作对照，大小1㎝2，放入盛有0.2mol/L磷酸盐缓冲液[PBS]（pH6.8）的青霉素瓶中； 2. 吸去缓冲液，加入1％ Triton X-100处理洋葱内表皮20-30 min； 3. 吸Triton X-100，用M-缓冲液充分清洗3次，每次3min； 4. 用3%戊二醛固定20min； 5. 用[PBS]清洗3次，每次10min； 6. 0.2％考马斯亮兰R250染色20-30min； 7. 用蒸馏水清洗1-2次； 8. 压片，镜检。

结果微丝束呈深蓝色,Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用： 非离子去垢剂 适当浓度的Triton X-100，破坏膜结构、可使细胞膜溶解，而细胞质中的细胞骨架系统可被保存； M－缓冲液 和磷酸缓冲液作用: 清洗组织细胞、稳定骨架蛋白，维持细胞的渗透压； EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇双醚四乙酸）作用： 前者可螯合大部分金属离子；后者专一性螯合Ca2＋，主要是高浓度的Ca2＋可是微管解聚，因此加入EGTA来降低Ca2＋的浓度； 戊二醛作用： 良好的固定剂，使细胞结构保持它原有状态； 考马斯亮兰作用： 非专一性结合蛋白质，使蛋白着色（蓝色）实验的关键：,Triton X-100 抽提处理的时间很关键，如果处理时间太短，没有抽提掉细胞器膜上的蛋白，会造成很深的背景颜色，干扰细胞骨架的观察；如果处理时间太长，会破坏骨架蛋白使骨架纤维断裂五 、实验结果,洋葱内表皮细胞骨架的考马斯亮兰染色结果 洋葱鳞茎外层与内层的内表皮细胞比较（放大倍数10×20） 左：鳞茎外层（对照）；右鳞茎内层,四、实验方法与步骤,（一）实验准备 试剂的配制； 实验材料的预处理； 实验方法的设计。

改变TritonX-100的浓度和作用时间,温度、pH值、金属离子对细胞骨架的影响,探究内容：,。