表小檗碱体外大鼠肝微粒体孵育代谢产物鉴定及对YP26酶活性的抑制作用.doc

表小案碱体外大鼠肝微粒体孵育代谢产物鉴定及对CYP2D6酶活性的 抑制作用表小璧碱体外大鼠肝微粒体孵育代谢产物鉴定及对CYP2D6酶活性的 抑制作用[摘要]表小果碱是黄连中一种主要的异喳琳类生物碱，具有多 种重要的药理活性该实验利用体外大鼠肝微粒体孵育体系，采用 LC-MS/MS分析鉴定表小案碱体外大鼠肝微粒体(RLM)共孵育后的I 相和II相代谢产物，采用cocktail探针药物法，通过同时测定美托 洛尔、氨苯碉、非那西丁、氯陛沙宗、甲苯磺丁服的含量变化，评价 不同浓度表小果碱对大鼠肝微粒体CYP2D6, CYP3A4, CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9亚型活性的影响结果表明，表小果碱在大鼠肝脏可发生I 相和II相代谢，从表小果碱的大鼠体外肝微粒体温孵体系中鉴定出2 个I相代谢产物和3个II相代谢产物；表小橐碱对肝脏CYP2D6酶呈 显著抑制作用，半数抑制浓度IC50为35. 22 umol - L^-l, 而对CYP3A4, CYP1A2, CYP2E1, CYP2C9酶的活性没有明显的影响, 提示表小橐碱可能存在基于CYP2D6酶的匆物相互作用该研究可为 合理开发利用表小聚碱提供实验依据。

[关键词]表小案碱；大鼠；肝微粒体；代谢产物；CYP450酶 细胞色素P450酶 (cytochrome P450, CYP450)是参与体内药物代谢的重要酶系 ^[l]o某一药物对CYP450酶的抑制或诱导，可能会影响 同时给药的其他药物的代谢^[2],被认为是引起药物相互 作用的重要因素^[3]o因此，研究药物的代谢途径，以及 药物对代谢酶的作用，对了解药物相互作用、制定合理的临床用药方 案等，具有重要指导意义^[4]o表小栗碱是黄连中一种重 要的异喳琳类生物碱，其互变异构体分子结构见图1研究表明表小 聚碱具有较强的抗氧化活性〈sup> [5] ,能够抑制醛糖还原酶, 降血糖，对抗糖尿病潜在并发，其作用强于小璧碱^[6-8]o 表小果碱虽然有重要的药用价值，但迄今有关其体内过程的研究鲜有报道本实验旨在通过分析表小璧碱肝脏代谢产物探讨其在体内的主 要代谢途径，并采用cocktail探针药物法同时测定6种CYP450亚酶 底物的含量，评价表小髡碱对大鼠肝微粒体（rat liver microsomes, RLM） CYP450不同亚型活性的影响，为表小璧碱的开发和药物相互作 用预测提供实验依据。

1材料 1.1仪器 ThermoFisher Scientific TSQ Quantum 液质联用仪（包括 Surveyor AS, Surveyor LC Pump, Surveyor PDA, TSQ Quantum）,配有大气压化学 离子源（APCI）和电喷雾离子源（ESI）及Xcalibur数据系统；Agilent 高效液相色谱仪HP1100系列（美国Agilent公司）；TGL 20M型高速 冷冻离心机（长沙湘智离心机仪器有限公司）；VORTEX GENIVS 3漩 涡混匀仪（IKA）； DKZ-450B型电热恒温振荡水槽（上海森信实验仪 器有限公司）；MTN-2800D型氮气吹干仪（天津奥特赛恩斯仪器有限 公司） 1.2药品及试剂 盐酸表小聚碱（批号must-12111601,纯度>98%）购自成都曼思特生物技术有限公司;美 托洛尔、氨苯飒、非那西丁、氯哇沙宗、甲苯磺丁腿、氧化型辅酶II 二钠（NADPNa2）、D-葡萄糖-6-磷酸二钠和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶均 购于北京拜耳迪生物技术有限公司（Sigma公司分装）；尿昔-5 -二 磷酸萄糖醛酸三钠盐（UDPGA）、丙甲菌素、D-糖酸-1, 4-内酯均购自 BD公司；乙月青为色谱纯（Fisher Company, Inc.美国）；水为超纯 水；其他试剂均为分析纯。

1.3动物 清洁级Sprague-Dawley （SD）雄性大鼠，体重（22020） g,北京维通 利华实验动物中心提供，许可证编号SCXK （京）2013-0001 o 2 方法 2. 1肝微粒体制备 采用钙盐沉淀法制备大鼠肝微粒体^[9]o空白大鼠，麻醉放血处死后，取出肝脏称重按 1 : 3加入Tris缓冲液，用内切式组织匀浆机在冰浴中制成匀浆液 将匀浆液于4 C, 9 000Xg离心20 min,再取上清液与88 mmol・ L^{-K/sup> CaC12溶液混匀，使终浓度为8 mmol - L-K/sup> CaC12,冰浴 5 min； 4 C, 27 000Xg 离心 20 min, 用上述缓冲液洗涤沉淀1次,所得微粒体以0. 15 mol - L-l Tris-0. 25 mol - L-K/sup>蔗糖缓冲液（pH 7. 4）混悬,分装， -80 C冷冻保存备用用考马斯亮蓝法测定肝微粒体蛋白浓度[10]o 2. 2温孵条件及样品处理 2. 2. 1表小璧碱肝微粒体I相反应体系温孵肝微粒体孵育体系包含终浓度为1 g ■ L-l的 RLM 和 30 mmol ・ L-l的表小栗碱， 和1佶体积的NADPH再生系统(相当于终浓度为0. 5 mmol - L~K/sup> NADPNa2, 10 nunol ■ L-K/sup> G-6-P, 1U ・ L-K/sup> G-6-PDH, 10 mmol ・ L-K/sup> MgC12)和一1 定量的KC1缓冲液。}

总体积为200 u L采用5 mL聚丙烯离心管37 C 水浴孵育，除NADPH再生系统外，其他组分首先37 C预温孵5 min, 然后加入NADPH再生系统启动反应，37 C水浴振荡有氧孵育40 min 后，加入3倍体积的冰冷甲醇终止反应，1万Xg, 4 C离心20 min 后取上清进样10 UL,进行LC-MS/MS代谢物分析，每个样本均做3 个重复 2. 2. 2 表小聚碱肝微粒体II相反应体系温孵^[ll]将RLM、磷酸钾缓冲液 和丙甲菌素冰浴15 min后，加入D-糖酸-1,4-内酯37 C温孵5 min, 然后加入NADP启动系统和UDGPA系统启动反应反应总体系为300 U L,其中含有 1 g ■ L^{-K/sup> RLM, 25 mg ■ L-l I为甲菌素，5 mmol ■ L-K/sup> D-糖酸T, 4-内酯，1 mmol ・ L-K/sup> NADPH 和 5 mmol - L-K/sup> UDPGA,表小案 碱终浓度为30 mmol ■ L-l,反应体系中有机溶剂质量分 数不超过3%, 37 C水浴振荡有氧孵育40 min后，加入3倍体积的 冰冷甲醇终止反应，1万Xg, 4C离心20 min后取上清进样10 u L, 进行LC-MS/MS分析，每个样本均做3个重复。}

2. 2. 3探针药物肝微粒体温孵 将各探针药物与RLM于37 C水浴中预温孵5 min,加 入 NADPH 发生系统(终浓度含 1 mmol • L〈sup〉T〈/sup〉NADPNa2, 20 mmol ■ L^{-K/sup> G-6一P, 2 U ■ L~K/sup> G-6-PDH, 20 mmol ■ L-K/sup> MgC12),用 0. 15 mol ・ L〈sup〉T〈/sup> 的KC1缓冲液(pH 7.4)定容使整个温孵体系终体积为0.4 mL (含 有美托洛尔 20 u mol ■ L-K/sup>> 氨苯飒 25 p mol ■ L-K/sup>> 非那西丁 25 u mol • L-l> 氯哩沙宗 25 u mol • L-l> 甲苯磺丁服 25 u mol ■ L-K/sup>) 和1 g ■ L~K/sup>蛋白，于37 C水浴中均匀振荡40 mino取出体外温孵样品放入冰浴中，按1 ： 3加入冰冷的甲醇终止反应，同 时加入内标物0.06 g ■ L-K/sup>五味子醇甲20 u L,振摇30 s,于4 C, 1万Xg离心20 mine吸取上清夜氮气吹干，甲醇(400 UL)复容，4 C, 1万Xg,离心20 min,取上清进样20 u L,进 行HPLC分析,每个样本均做3个重复。}

2.3色谱条件 2. 3. 1表小髡碱肝微粒体代谢物LC-MS检测条件 色谱条件Agilent Eclipse XDB-C18 Column (4.6 mmX250 mm, 5 nm)；流动相乙月青-0. 1%甲 酸溶液(25 : 75)o流速1 mL - min^{-K/sup>；紫外检测波长270 nm；柱温30 C；进样量10 u L；柱后1 ： 4分流 LC-MS/MS 条件：ESI离子源，扫描范围m/z 50-700,喷雾电压3 500 V,毛 细管温度350 C,鞘气(N2)流速10.0 L・h〈sup〉T〈/sup>采用 自动迸样器迸样,正离子模式检测 2. 3.2探针药物HPLC检测条件[12] 采用 Agilent SB-C18 柱(4.6 mmX 150 mm, 5 U m),流速 1. 0 mL ■ min-l,柱温 40 C,进样 20 u L 流动相A为磷酸氢二胺缓冲盐(pH 3. 6), B为乙腊，梯度洗脱0〜4 min, 32% B； 4〜25 min, 32%〜55% B； 25-35 min, 55%〜32% Bo 检测波 长230 nnio 2.4表小棠碱对各亚酶活性的影响 在孵育体系中，保持美托洛尔的浓度为20 nmol - L-K/sup>>氨苯碉 的浓度为25 u mol・L〈sup〉T〈/sup〉、非那西丁的浓度为25 u mol ・ L〈sup>T〈/sup>、氯陛沙宗的浓度为 25 u mol ・ L-K/sup>,变化表小栗碱的 终浓度至 10, 20, 40, 80, 160 nmol - L-lo 温孵反应 分为不加NADPH的对照组、不加表小果碱的阴性对照组和实验组进行, 反应样本数均为6个样本。}

根据2.2.3项的步骤温孵和处理样品,HPLC 测定孵育液中底物剩余浓度，计算代谢消除率(RMCR),考察表小案 碱对各底物代谢的抑制能力，并计算半数抑制浓度IC50o 2. 5数据处理 探针底物相对代谢消除率(RMCR)的计算方式：RMCR二CO-CtCO-Ct=0X100%CO,温孵体系中探针底物的初始浓度； Ct,实验组探针底物的剩余浓度；Ct=0,阴性对照组探针底物的剩余 浓度 3结果 3. 1 I相代谢产物的鉴定 将表小棠碱20 u mol - L^{-K/sup>与RLM和NADPH共温孵后,发现新增2个色谱峰，其保留时间分别为4. 49 min (M-1)和5.02 min (M-2),见 图2这2个色谱峰在肝微粒体灭活样品和不加NADPH样品中均没有 检测到M-1 (m/z 322)的分子离子分别比原药分子离子(m/z 336) 少14 Da,同时，MT分子离子的主要二级碎片离子为(m/z 307), 比MT的分子离子少15 Da,是MT脱亚甲基。}