《论文_微生物果胶酶研究进展(定稿)》.docx

微生物果胶酶研究进展及其在果蔬加工中的应用马蕾(四川大学牛命科学学院牛物技术专业)摘要：果胶酶在工业生产领域中是一种至要的新型酶类，在果蔬加工、饲料、纺织和制造 工业中应用非常广泛近年来研究进展较为迅速木文介绍了杲胶酶的微生物来源，从果胶 酶的分类、理化性质、微生物果胶酶的酶学性质及在果蔬加工应用方而加以论述关键词:酶活测立方法果蔬加工前言果胶质广泛存在于高等植物中，是植物细胞胞间层和初生壁的重要组成成分，植物的细 胞组织间起“黏合”作丿IJ近儿年来，果胶质的生物降解口益引起国内外学者的广泛关注 能够分解果胶质的酶被称作果胶酶(pectinase),它广泛存在丁•各种微生物中，细菌、真菌和 放线菌都能产生相关酶类果胶酶类的应用领域非常广泛，不仅可用于食品工业如水杲加工 及葡萄酒生产等方面，还广泛应川于麻类脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化 处理和饲料等行业中果胶酶主要分为原果胶酶、聚半乳糖醛酸酶、裂解酶和果胶酯酶等儿 大类，研究果胶酶各组分的性质，有利丁•果胶晦的单一酶种的开发利川同时微牛物果胶酶 的分子牛物学研究将有助于更合理地利用果胶陋1、杲胶简介果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以a-1, 4糖甘键聚合而成的多糖链，常带有鼠李糖、 阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的竣基部分或全部与鈣、钾、 钠离子，特别是与硼化合物结合在一起［1］。

它心在于所有的高等植物中，沉积于初生细胞 壁和细胞间层，在初牛壁中与不同含量的纤维素、半纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展 蛋tl(extensin)⑵相互交联，使各种细胞组织结构坚硬，表现出固有的形态.果胶分子的结 构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同，其大致的结构简图如图1所示，总 体可分为光滑区(smooth region)和须状R(hairy region)两部分，主要由HGA、RG-I和RG-II 三个结构区域构成，其中RG-II常以二聚体的形式存在.同其它植物多糖一样，果胶也是多 分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的，也具有一定的相对分子质量分布中国发酵李半乳■莊 .3履畝来苏庚筲狈血• aFucO 乙■甲 MAcMeFw ▲乙 SIR Ac Ace均聚半乳牺醛酸 Homogalacturonao (HGA)Si果胶的结构简图•単乳▲阿控伯希Aft■ 1-MM 甘■辛 WMkdo▲序莫・Api♦甲篇木箝Mny!△木 Xyi■甲 SMcthylA 乙 ttSAcetyl2、 果胶酚分类从广义上讲，果胶酶可以被分为3种类型：①原果胶酶：可以把不溶于水的原果胶分解为可 溶于水的高聚合体果胶；②果胶酯酶：脱去果胶小的甲氧基基团，促使果胶的脱甲酯作用； ③解聚酶：促使果胶中D-半乳糖醛酸的a-l, 4糖昔键的裂解。

近来人们提出了更详细分类 方法为［3］：原果胶酶(protopectinases)＞多聚半乳糖醛酸酶(Polygalac(uronases)、裂解酶(pectin lyases, PL)＞ 果胶酯酶(Pectinesterase, PE)2.1原果胶酶Bri伽等人⑷把能够促使原果胶溶解的臨命名为原果胶酶根据其作用机理分为两种类型： A型原果胶酶与B型原果胶酶前者主要作川于原果胶的内部的多聚半乳糖醛酸区域而 后者主要作用于外部的连接聚半乳糖醛酸链和细胞壁组分的多糖链2.2 多聚半乳糖醛酸 ^(Polygalacturonases)聚半乳糖醛酸酶是在有水环境下促进聚半乳糖醛酸链水解的一种果胶酶，应用最为广泛根 据水解作用机理不同，它可以分为内切聚半乳糖醛酸卿(E.C.3.2.1.15)和外切聚半乳糖醛酸嗨 (E.C.3.2.1.67)外切酶乂可以划分两种类型：一种是真菌外切聚半乳糖醛酸酶，它的终产物 是单体半乳糖醛酸;另一种是细菌外切聚半乳糖醛酸酶，它的终产物是二聚体的半乳糖醛酸2.3 裂解晦(pectin lyases, PL)裂解酶(反式消去酶)是通过反式消去作川裂解果胶聚合体的一种果胶酶，裂解酶在C-4位置 上断开糖昔键，同时从C-5处消去一个H原子从而产生一个不饱和产物。

根据其作用机理 以及作用底物的不同，裂解酶可以划分为：① 内切聚半乳糖醛酸裂解酶(EndoPGL, E.C.4.2.2.2)；②外切聚半乳糖醛酸裂解酶(ExoPGL, E.C.4.2.2.9)；③内切聚甲基半乳糖醛 酸裂解酶(EndoPMGL, E.C.4.2.2.10)；④外切聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(ExoPMGL)3、 果胶酶产生菌忖前国内外研究和应用较多的果胶酶产牛菌是细菌和需菌［5, 6］,也有链霉菌产牛果胶嗨的 报道⑺在细菌中,欧文氏杆菌(Erwiniasp.)s芽砲杆菌(Bacillus sp.)＞节杆菌(Arthrobacter sp.)和假单•胞杆菌(Pseodomonas sp.)都产生果胶酶嗜碱性芽:杆菌属和欧文氏杆菌属主要用 于在芒麻和红麻的脱胶、生物制浆及污物的处理软化等方而，应用前景可观，受到较多的关 注和研究已见报道的产果胶酶的霉菌种类人约包括20个属,如町霉属(Aspergillus sp.)、 灰霉菌属(Botrytis sp.)＞镰砲菌属(Fusarium sp.)＞炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、核盘菌属 (Scletorium sp.)和玉圆斑菌属(Cochliobolus sp.)等。

目前，黑曲雷、根宙和盾克宙作为产果胶 酶的菌株C经商品化国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究主要集中在曲霉属中，而曲霉属中 研究最多的是黑曲霉其原因是，果胶酶被广泛应用于食品工业中，如用于果汁、果酒及中 药营养液的深加工等，使得产品质量和外观得以改善，而生产食品酶制剂的菌株必须是安全 菌株黑曲霉分泌的胞外酶系较全，不仅可以产生大量杲胶酶，而月.黑曲霉属于安全菌株 另外，黑曲霉产牛的果胶酶故适pH值一般在酸性范围内，这也是其被应用于食品工业行业 中的原因Z—A型原果胶酶主要來源于酵母及酵母状真菌的发酵液中研究人员己经从Kluyveromy cesfragilis 1FO028& Galactomyces reesei L.和 Trichosporon penicilla- turn SNO 3⑻中分离出了 原果胶酶.依次称为原果胶酶-F, -L和・S(PPase-F.・L.・S),另外从Bacillus subtilis IFO12113, B. subtilis IFO3134和Tramete sp.菌株中分离出了 B-型原果胶酶［8］,依次称为原果胶酶-B, -C 和-T(PPase-B, -C 和-T)。

内切聚半乳糖醛酸酶广泛分如于真菌和细菌中，在一些高等植物和寄生于植物的线虫中我们 也发现了此种酶据报道，现在已经在许多微生物的菌体中发现了这种内切酶，包括 Aureobasidium pullulans, Rhizoctoniasolani Kuhn, Fusarium moniliforme, Neurospora crassa, Rhizopus stolonifer, Aspergillus sp, Thermomyces lanuginosus, Peacilomyces clavisporus 等 科研人员已经在大量的微牛物种类中，对内切聚半乳糖醛酸酶进行了克隆复制，在遗传学方 血进行了大量的研究相对而言，产生外切聚半乳糖醛酸酶的微牛物较少已经报道的产生 外切活性酶的微生物有：Erwiniacarotovora,Agrobacterium tumefaciens,Bacteroides thetaiotamicron, E. chrysanthemi, Al te man a mali, Fusarium oxysporum, Ralstonia solanacearum, Bacillus sp.等［9・11］。

聚半乳糖醛酸裂解B(PGLs)可以由多种细菌和一些致病性的真菌产生，内切聚半乳糖醛酸裂 解酶比外切聚半乳糖醛酸裂解酶要丰富对以从腐烂食物中的细菌和真菌中分离到PGLso 据扌艮道，Colletotrichum lindemuthionum, Bacteroides thetaiotaomicron, Erwinia cartovora, A mucala sp, Pseudomonas syringae pv. Glycinea, Colletotrichummagna,E. chrysanthemi, Bacillus sp, Bacillus sp. DT-7, C. gloeosporioides 等［12,13］菌株中可以分离到此种酹相比 之下关于聚甲基半乳糖醛酸裂解酶(PMGLs)的产品却鲜于报道，仅有少数报道指出我们可以 从 As. pergillusjaponicus, Penicillium paxilli, Penicillium sp., Pythium splendens , Pichia pinus, Aspergillus sp., Thermoascusauratniacus 中分离到此种酶［13-15］。

3、杲胶酶的理化性质3.1 杲胶酚活力检测方法掌握可靠的酶分析定量方法是开展果胶晦研究工作的重要前提果胶酶的测定方法很 多，各具特点，口酶活单位的定义不同，要根据不同情况加以选择对比常用的酶活力测定 方法有：3.1.1滴定法滴定法主要川于测定果胶酯酶的活力，根据该酶作川机制，采川滴定竣基来评价酶活 果胶酯酶的活力还有一种测定方法，即，通过气相色谱或液相色谱仪定童分析甲醇，根据甲 醇的牛成量来评价酶活，此方法比较精确但要求鮫高3.1.2黏度下降法黏度下降法基于果胶物质在酶的作川下人分子降解伴随底物溶液黏度卞降这一事实，以 底物黏度下降的百分比来评价酶活该方法所测定的酶活性，主要是反映内切酶酶活3.1.3脱胶作用时间法该方法根据果胶物质在未被酶解之前以及在酶解反应的不同时期能在异丙醇溶剂中形 成大小不等的胶团而判断晦的活性该方法最能反映内切水解酶和内切裂解酶两种晦在实验 条件下的综合能力3.1.4还原糖测定法无论是内切还是外切果胶酶的作用，长链果胶分子的糖甘键断裂结果都产生还原端基 这些还原端基的生成量可用来表示酶活性最为常用的为DNS(3, 5—二硝基水杨酸)法3.1.5 235nm处紫外吸收测定法这是专门测定裂解酶活力的一种方法。

裂解酶作用于底物经历一个B —消除反应，使底 物牛成1F•述原末端C4、C5 Z间带有双键的产物，该产物在235nm处产牛故大紫外吸收， 酶活性测定正是根据该反应产物而设计的3.2微生物果胶酶的酶学性质国内外科学家利川层析、电泳等手段对果胶酶的酶学性质进行了研究，明确了一些果胶 酶的分子量、动力学性质及其影响因索常川果胶酶纯化方法令：硫酸钱沉淀、丙酮沉淀、 离子交换层析以及凝胶过滤色谱等果胶酶分子量一燉在20kD〜60kD之间，虹体存在，个 别以多聚体形式存在，如海栖热袍菌果胶酸裂解酶分子量为H5.2RD,结构为四聚体通常 果胶酶活性范围在pH3.0〜9.0,等电点pH4.0-9.0o其中，最适pH4.0〜6.5的为水解酶，其作 用不需要Ca2+参与而裂解酶的作用需要Ca2+参与，最适pH为&0〜10.0不同菌种所产 杲胶酶性质有所不同Alana等人采川了半固体和液体发酵两种不同的培养方式，采取凝胶 过滤色谱和层析聚焦两种牛化手段对Penicillium italicum牛产果胶酶进行研究，发现两种培 养方式产牛的酶分子量、等电点、Km都相同，分别为22kD、&6、3.2mg/mlo最适作用。