第二章染色体与dna3复制.ppt

学习目的和要求 熟悉DNA复制的一般规律，掌握DNA复制的特点；掌握真核生物和原核生物DNA复制的异同点；理解DNA复制的基本过程二、DNA的复制与调控,（教材P.37-51）,1、DNA复制的半保留性,全保留复制模型(conservative replication model）两条母链彼此结合，恢复原状，新合成的两条子链彼此互补结合形成一条新的双链一）DNA复制概况,分散模型(dispersive model)亲代双链被切成双链片段，而这些片段又可作为新合成双链片段的模板，新、老双链片段又以某种方式聚集成“杂种链”,半保留复制模型(semiconservative replication model）DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂两条链分开，然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链，这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的半保留复制的实验证据 （Meselson 和 Stahl，1958）,,复制叉与复制泡,从打开的起点向一个方向形成一个的叉形或Y形,从打开的起点向两个方向形成,复制开始时，双链打开,,,2、DNA复制的半不连续性,前导链,RNA引物,岗崎片段,随从链,,原核： 1000-2000bp真核： 100-200bp,依DNA合成的起始方式，复制可分为从新起始与共价延伸两种类型。

前者是前导链从新开始，也叫复制叉式复制；后者是先导链共价结合在一条亲代链上，也叫滚环式复制二）DNA复制的几种主要方式,1、复制叉式复制复制叉式复制是真核生物和原核生物中普遍存在的DNA复制方式滚环式复制是单向复制的特殊方式，是某些噬菌体DNA复制的共同方式另外某些双链DNA的合成也通过滚环复制的方式进行2、滚环式复制,（1）σ滚环复制,（2）噜噗滚环复制（looped rolling circle replication）,（3）线粒体DNA的D-噜噗(displacement loop)复制,(4) θ型,DNA复制的全部过程可以人为地分成三个阶段第一阶段为DNA复制的起始阶段，这个阶段包括起始点，复制方向以及引发体的形成；第二阶段为DNA链的延长，包括前导链及随从链的形成和切除RNA引物后填补空缺及连接岗崎片段；第三阶段为DNA复制的终止阶段在DNA复制的整个过程中需要30多种酶及蛋白质分子参加,（三）DNA复制的过程,（1）DNA复制的起始点(origin of replication)：复制起始的特定DNA序列 ,复制起点的一般特征： 1、它们都由多个独特的短重复序列组成； 2、这些短重复序列被亚多基的复制起点结合蛋白所识别；它对于在复制起点组装复制酶具有关键作用； 3、复制起点附近一般有一个富含A-T的序列，以利于双螺旋DNA解链或解旋，并产生单链DNA复制模板。

复制子或复制单元（replicon）：染色体上能够进行独立复制的单位细菌一个复制子，真核生物一条染色体上多个复制子1、DNA复制的起始阶段,① 定点开始双向复制原核生物和真核生物DNA复制最主要的形式,② 定点开始单向复制质粒colE1,（2）DNA复制的方向,,③ 两点开始单向复制腺病毒DNA的复制,① 解链酶(helicase),（3）DNA复制起始、引发体的形成及所参与的酶和蛋白质,DNA复制、修复、重组及接合过程，两条互补链必须部分分开形成单链DNA中间体--解旋---螺旋酶催化发动蛋白，具有依赖DNA的ATPase活性，把ATP水解产生的自由能转化为解旋DNA并使螺旋酶本身沿DNA链移动的机械能 500-1000bp/秒真核生物转录复合物的组分，有些螺旋酶具有RNA螺旋酶活性,② 单链结合蛋白(single strand binding proteins, SSBP),又称为双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizingprotein） 由177个aa组成 在E.coli 中以四聚体存在 分子量为74KDa 在原核中SSB与DNA结合表现出协同效应A. SSB之间的相互作用；B. 第一个SSB和DNA的结合改变了DNA的结构。

③ 引发体的形成,A. 引物酶(primase),B. 引发体(primosome),（1）DNA的聚合反应和DNA聚合酶,2、DNA复制的延长阶段以及参与的酶和蛋白质分子,,DNA聚合酶的共同特点,第一，需要提供合成模板； 第二，不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3'－OH； 第三，合成的方向都是5’ →3’ 第四，除聚合DNA外还有其它功能,① DNA聚合酶I,DNA polⅠ是由一条多肽链组成，分子量为109KD酶分子中含有一个Zn++，是聚合活性必须的DNA聚合酶有6个结合位点：模板结合位点；引物结合位点；引物3’－OH结合位点；底物dNTP结合位点；5’→3’外切酶结合位点；3'→5'校正位点DNA聚合酶Ⅰ的功能,A. 5’→3’聚合活性,图 DNA聚合酶催化的DNA链延长,B. 3’→5’外切活性,C. 5’→3’外切活性切口平移（nick translation）；链的置换；模板转换（template-switching）,缺刻平移标记DNA探针,D. 内切酶活性,大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段（E.coliDNA PolⅠ Klenow fragment），又叫做Klenow聚合酶或Klenow大片段酶。

它是由大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ全酶，经枯草杆菌蛋白酶（一种蛋白质分解酶）处理之后，产生出来的分子量为76KD的大片段分子Klenow聚合酶仍具有5′→ 3′的聚合活性和3′→ 5′核酸外切酶活性，但失去了全酶的5′→ 3′的核酸外切酶活性 在DNA分子克隆中，Klenow聚合酶的主要用途有：（i）修补经限制酶消化的DNA所形成的3′隐蔽末端；（ii）标记DNA片段的末端； （iii）cDNA克隆中的第二链cDNA的合成； （iv）DNA序列测定Klenow片段,分子量120KD100个酶分子/细胞活性是DNA pol I的5%具有5′→3′聚合活性和3′→5′外切活性没有5′→3′外切活性与DNA修复有关,② DNA聚合酶II,DNA复制过程中起主要作用的酶由一个多亚基组成的蛋白分子,③ DNA聚合酶III,大肠杆菌DNA聚合酶特征,拓扑异构酶(topoisomerase) 上一堂课已经介绍过2)与超螺旋松驰有关的酶,表 大肠杆菌和真核生物中的拓扑异构酶,3、DNA复制的终止阶段,连接酶(ligase),连接酶的催化反应,复制终点（terminus）：决定复制终止的DNA片段其作用机制是分三步进行：E＋ATP→E－AMP＋ppi在E.coli中，E＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸）E-AMP上的AMP转移到DNA的5’-PO4上使其活化活化的5’－PO4与相邻的3’－OH作用形成3’－5’磷酸二酯键，并释放出AMP。

E.coli的复制终止现已发现有两个终止区域（terE,D,A和ter C,B），位于相遇点的另一侧100Kb处每一终止顺序对某一方向移动的复制叉来说是特异的ter顺序有一个23bp的区域，在体外可导致复制的终止，但其功能显示了一定的方向性终止需要tus(terminus utilization substance)基因的产物Tus(36kD)， Tus能识别ter保守顺序，并阻止复制叉继续前进ter-Tus复合物可能通过抑制螺旋酶来实行终止,1、与原核生物不同，真核生物DNA复制有许多起始点2、真核生物DNA复制的速度(60核苷酸/每秒钟)比原核生物DNA复制的速度(E.coli 1700核苷酸/每秒钟)慢,3、真核生物的染色体在全部完成复制之前，各个起始点上的DNA的复制不能再开始，而在快速生长的原核生物中，复制起始点可以连续开始新的DNA复制，表现为虽只有一个复制单元，但可有多个复制叉四）真核生物DNA复制的特点,4、真核生物DNA的复制子被称为ARS（autonomously replicating sequences），长约150bp，包括数个复制起始必需的保守区真核生物DNA复制的起始需要起始原点识别复合物（ORC）参与。

5、在真核生物中主要有5种DNA聚合酶，分别为DNA聚合酶α、β、γ、δ和ε，其特性如下表真核生物的DNA聚合酶一般都不具有核酸外切酶活性,推测一定有另外的酶在DNA复制中起校对作用真核生物DNA聚合酶,6、端粒复制,端粒复制的生物学意义： （1）维持染色体的完成性，决定细胞的寿命； （2）维持染色体的独立性，若无端粒，两个染色体末端很可能融合到一起； （3）解决末端复制问题，端粒酶能与端粒作用，延伸其长度端粒酶催化端区TG链的合成,（五）DNA复制的忠实性和调控,1、DNA复制的忠实性（fidelity）,(二)DNA聚合酶的自我校正,(三)DNA聚合酶催化的反应机制,(四)错配校正系统,问题: 为什么在DNA复制起始要使用需要清除的RNA作为引物，而不使用可以不必清除的DNA为引物呢？,在DNA复制中，开始从头合成的引物（RNA或DNA）拷贝碱基容易错配，误差率至少为10-4；而且，开始阶段所形成的短核苷酸序列中的错配碱基也不易被校正如果冈崎片段中的这些引物拷贝作为终产物保留下来，即使它们所占的比例只有5%，也会造成基因突变大大增加因此，DNA复制中从头合成的引物最终必须除去，而用RNA引物要比DNA引物有利得多，因为RNA引物的核苷酸序列即使有错配最终也被清除，并由DNA聚合酶I合成的正确短DNA片段来填补。

五）DNA复制的忠实性和调控,1、DNA复制的忠实性（fidelity）,(一)RNA引物,为什么在DNA复制起始要使用需要清除的RNA作为引物，而不使用可以不必清除的DNA为引物呢？,(二)DNA聚合酶的自我校正,(三)DNA聚合酶催化的反应机制,(四)错配校正系统,,起始被GATC半甲基化抑制 (13min,1.5min) 起始需复制起始点的Dam靶序列完全甲基化,2、DNA复制的调控,复制的调控发生在起始阶段，从复制原点起始一轮DNA复制，特异性蛋白因子对原点的识别和结合是关键的一步当DNA复制起始以后，这种可为复制机构所利用的状态发生了改变，或者是DNA被修饰酶（如甲基化和去甲基化等），或者是特异性蛋白质因子被修饰（磷酸化和去磷酸化等）这样，使得在一个细胞周期中，复制原点通常只能被使用一次总之，DNA复制是由活化物、阻遏物及它们的相互作用调节的DNA复制的调控，包括DNA水平、RNA水平以及蛋白水平1）大肠杆菌染色体DNA的复制调控,细胞内dnaA蛋白在起始时起关键作用，它的浓度决定了oriC质粒复制起始频率半甲基化：oriC亲代链保持甲基化，新合成的链则未被甲基化oriC和dnaA位点再甲基化的延迟,（2）ColE1质粒DNA的复制调控,（3）单链DNA噬菌体的复制调控,角噬菌体（ФX174、G4、S13）,丝状噬菌体（M13、fl、fd）,基因A在复制调控中起关键作用，编码两个蛋白A和A*，A*蛋白仅有A蛋白的羧基端肽链,基因II和基因V产物,（4）真核细胞DNA的复制调控,① 真核细胞DNA 复制的3个调控水平,A. 细胞周期水平调控B. 染色体水平调控C. 复制子水平调控,② 病毒SV40 DNA的复制调控,大T抗原,三个功能区：前期区、中心区和后期区,③ 酵母染色体DNA的复制调控酵母复制起始受时序调控，也受α因子和cdc基因调控。

已克隆的ARS片段中都有14bp的核心序列，其中序列为A（或T）TT-TATPuTTA的11bp是高度保守的，这个区域的点突变使ARS失去复制起始功能DNA复制过程中的共同特征,（1）半保留复制； （2）形成复制叉结构； （3）半不连续复制； （4）复制起点具有特殊序列； （5）需要RNA引物； （6）复制的高度忠实性复习思考题,1、什么是半保留复制？什么是半不连续性复制？半保留复制有什么生物学意义？ 2、简述DNA复制的几种方式及其特点 3、简述DNA复制的过程及涉及到的关键的酶或蛋白质 4、原核生物DNA复制和真核生物DNA复制有何异同？ 5、简述端粒酶的作用机制及端粒复制的生物学意义 6、简述真核细胞DNA复制的三个调控水平 7、几个名词： 复制叉、复制子、前导链和滞后链、冈崎片段、DNA聚合酶,。