1口腔粘膜细胞基因组dna制备-201509.ppt

分子医学技能实验,袁 洁 生物化学教研室,实验一 口腔粘膜细胞基因组DNA制备,基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交（包括RFLP）及PCR分离基因等 是一般的基因工程实验中DNA操作的最初步骤一、基因组DNA的提取与纯化,目的：,二、人基因组DNA的制备,实验目的及意义： 从人口腔上皮细胞中提取纯的基因组DNA 掌握基因组DNA抽提的方法，理解核酸分离纯化的基本原理,分离纯化基因组DNA的常用方法：,不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同，分离方法也有差异主要根据不同细胞的特点而有区别，但原理相似，因此它们有共同的步骤： 裂解细胞：SDS裂解细胞，EDTA抑制核酸酶 除去蛋白质：蛋白酶K水解蛋白质，酚和氯仿/异戊醇抽提、分离蛋白质； 析出DNA：乙醇沉淀使DNA从溶液中析出细胞样品的核酸提取的主要步骤,破碎细胞 去除细胞内的其它分子： 蛋白质 多糖 脂类 去除盐类、有机溶剂等杂质,实验材料及试剂,材料：人口腔上皮细胞 试剂： 抽提缓冲液：Tris-Cl pH8.0 ，EDTA，NaCl， RNAase， SDS，蛋白酶K 水饱和酚 氯仿/异戊醇（V/V=24:1） 70%乙醇、无水乙醇 TE缓冲液：Tris，EDTA,主要试剂的功能,抽提缓冲液：由SDS、EDTA、蛋白酶K组成 SDS的作用是裂解细胞 EDTA 的作用是络合掉镁等二价金属离子，防止DNA酶对DNA分子的降解作用。

蛋白酶K的作用是水解蛋白质 酚和氯仿/异戊醇：抽提分离蛋白质 乙醇：沉淀DNA TE：溶解DNA,取材:用生理盐水漱口后，口含生理盐水10~15ml约2~3min，用15ml离心管（4000rpm  10min）收集细胞沉淀 （离心机的使用，平衡） 加入0.5ml抽提缓冲液，重悬沉淀 ，转移至1.5ml EP管① （微量移液器的正确使用） 混匀，65℃ 温育30min 加入等体积的【饱和酚(~0.25ml)：氯仿/异戊醇(~0.25ml)】 充分颠倒混匀,,,,,（不要剧烈震荡！）,实验步骤及注意事项（一人一份）：,12000rpm5min，上层水相转移至新的EP管② （高速离心机的使用与安全意识） 加入等体积【氯仿/异戊醇】，颠倒混匀 12000rpm5min，上层水相转移到新的EP管③,,,,加入2倍体积 无水乙醇，颠倒混匀 12000rpm10min,,弃上清，沉淀中加入300 l 70%乙醇 12000rpm2min 轻轻弃去上清，打开EP盖，室温静置5~10min 加入30-50 l 0.1×TE溶液，充分混匀后检测结果,,,,核酸分离纯化的原则：  保证核酸一级结构完整  排除其它分子的污染： 细胞内：蛋白质、脂类、糖、RNA等 提取过程中：有机熔剂、金属离子、外源DNA,核酸提取注意事项,减少化学因素对核酸的降解 如过量酸碱 减少物理因素对核酸的降解 机械剪切力：强烈震荡、渗透压急剧改变、反复冻融 高温 防止核酸的生物降解 核酸酶的预防,常见问题： 1、提取的DNA不纯 原因？改进的方法？ 2、提取的DNA成涂布状 原因？改进的方法？ 3、没有获得足够量的DNA 改进的方法？,分子医学实验注意事项,微量移液器的正确使用 离心机的正确使用 上课纪律 撰写实验报告的规范,实验结果及其分析,定性分析：DNA琼脂糖凝胶电泳 HLA基因多态性分析 PCR,下次实验课进行,预 习,电泳的原理 基因诊断、分子诊断 PCR的原理 乙肝病毒临床检测方法 HLA基因,实验报告格式,实验目的和应用价值 实验原理 样品与试剂 实验基本流程和注意事项 实验结果和讨论 总结或感想,完成两部分的作业：课后作业，实验报告,其 它, 305333833,Thank You !,。