《RNA转录》课件.ppt

第三章第三章 RNA转录转录 (RNA transcription) 6.1. 基本概念基本概念6.2. 原核生物原核生物RNA转录的起始转录的起始6.3. 真核生物真核生物RNA转录的起始转录的起始6.4. 转录的延伸转录的延伸6.5. 转录的终止转录的终止6.6. 原核生物转录产物的后加工原核生物转录产物的后加工 6.7. 真核生物转录产物的后加工真核生物转录产物的后加工6.8. 真核生物转录产物中内元的去除真核生物转录产物中内元的去除 6.9. 不连续转录和反式拼接不连续转录和反式拼接第一第一节 基本概念基本概念  转录转录(transcription):是指以是指以DNA为模板，在依赖于为模板，在依赖于DNA的的 RNA聚和酶催化下，以聚和酶催化下，以4中中rNTP（（ATP、、 CTP、、GTP和和UTP）为原料，合成）为原料，合成RNA 的过程。

的过程 在有些病毒中，在有些病毒中，RNA也可以指导合成也可以指导合成RNA 若若 干干 基基 本本 概概 念念t 是基因表达的第一步，也是最关键的一步是基因表达的第一步，也是最关键的一步t 以以Double Strand DNA中的一条单链作为转录模板中的一条单链作为转录模板 (杂交实验所证实杂交实验所证实)• 有义链有义链 (sense strand) [又称编码链又称编码链 coding strand]: 指不作模板的指不作模板的DNA单链单链• 反义链反义链 (antisense strand) [又称模板链又称模板链 template srand] : 指作为模板进行指作为模板进行RNA转录的链转录的链 (60年代以前的表示方法与此相反年代以前的表示方法与此相反) 没有没有 A＝＝U G＝＝C 的规律的规律t 在依赖在依赖DNA的的RNA聚合酶作用下进行转录聚合酶作用下进行转录t A＝＝U、、C≡≡G 合成合成RNA分子分子t 转录合成转录合成RNA链的方向为链的方向为5’→3’，，模板单链模板单链DNA的极性的极性 方向为方向为3’→5’，， 而非模板单链的极性方向与而非模板单链的极性方向与RNA链相链相 同，均为同，均为5’→3’。

书写）书写） t 基因转录方式为不对称转录基因转录方式为不对称转录(一条单链一条单链DNA 为模板为模板,RNA 聚合酶的结合聚合酶的结合) t RNA 的转录包括的转录包括 promotion. elongation. terminaton 三过程三过程 t 从启动子从启动子 (promoter)到终止子到终止子(terminator)称为转录单称为转录单 位位 (transcription unit) (转录起始点转录起始点)t 原核生物的转录单位多为原核生物的转录单位多为 polycistron in operon,真真 核生物中的核生物中的 转录单位多为转录单位多为monocistron, No operon t 转录起点即转录原点记为＋转录起点即转录原点记为＋1，其上游记为负值，下游，其上游记为负值，下游 记为正值记为正值 upstream start point downstream－－10＋＋1＋＋10第二节第二节 原核生物原核生物RNA转录的起始转录的起始(RNA Transcription promotion in prokaryots)两个相关概念两个相关概念:＊＊ 操纵元操纵元(operon): 是原核生物基因是原核生物基因 表达调控的一个表达调控的一个 完整单元，其中完整单元，其中 包括结构基因、包括结构基因、 调节基因、操作调节基因、操作 子和启动子子和启动子ipozyaNo lac mRNAAbsence of lactoseActiveipozya-Galactosidase Permease TransacetylasePresence of lactose Inactive• 启动子启动子(promoter)：：是指是指DNA分子上被分子上被RNA聚合酶识别聚合酶识别 并结合形成起始转录复合物的区域并结合形成起始转录复合物的区域 ，它还包括一些调节，它还包括一些调节 蛋白因子的结合位点蛋白因子的结合位点 (频率、效率频率、效率) 一、原核生物的一、原核生物的RNA polymerase (E. coli)1、全酶、全酶 (Holo Enzyme)和核心酶和核心酶(Core Enzyme)＋＋σσββ’ααCore Enzyme βααβ’σHolo Enzyme (1) 全酶（全酶（Holo Enzyme）） • 用于转录的起始用于转录的起始 • 依靠空间结构与依靠空间结构与DNA模板结合模板结合 (σ与核心与核心酶结合合后后 引起的构象引起的构象变化化) • 专一性地与一性地与DNA序列序列(启启动子子)结合合 • 结合常数：合常数：1014／／mol • 半衰期：数小半衰期：数小时 （（107／／mol 1秒以下）秒以下） • 转录效率低，速度效率低，速度缓慢（慢（ σ的结合的结合 ）） （（2）） 核心酶核心酶 （（Core Enzyme）） • 作用于转录的延伸过程（终止）作用于转录的延伸过程（终止） • 依靠静电引力依靠静电引力与与DNA模板结合模板结合（蛋白质中碱性（蛋白质中碱性 基团与基团与DNA的磷酸根之的磷酸根之 间）间） • 非专一性的结合（与非专一性的结合（与DNA的序列无关）的序列无关） • 结合常数：结合常数：1011／／mol • 半衰期：半衰期：60秒秒 此外，新发现的一种此外，新发现的一种ω亚亚基的功能尚不清楚。

基的功能尚不清楚2、各、各亚亚基的特点和功能基的特点和功能 （（1）） σ 因子因子 • σ因子可重复使用因子可重复使用 • 修饰修饰RNApol构型构型 • 使使Holo Enzyme 识别启动子的识别启动子的Sextama Box(－－35区区), 并通过并通过σ与模板链结合与模板链结合2 α ＋＋ βα2ββ’＋＋σ α 2 β ＋＋ β’α2ββ’σ（（3）全酶的组装过程）全酶的组装过程 • 不同的不同的σ因子识别不同的启动子因子识别不同的启动子 E.coli 中有四种中有四种σ因子（因子（σ70、、σ32、、σ54、、σ28）） 枯草杆菌中有枯草杆菌中有11种种σ因子因子 （（σ因子的更替对转录起始的调控）因子的更替对转录起始的调控）（（2））α因子因子• 核心酶的组建因子核心酶的组建因子 • 促使促使RNApol 与与DNA模板链结合模板链结合α＋＋α 2α＋＋β α2β＋＋β’ • 前端前端α因子－－使模板因子－－使模板DNA双链解链为单链双链解链为单链 • 尾端尾端α因子－－使解链的单链因子－－使解链的单链DNA重新聚合为双链重新聚合为双链 （（3）） β因子因子• 促进促进RNApol＋＋NTP RNA elongation • 完成完成NMP之间的磷酸酯键的连接之间的磷酸酯键的连接 • Editing 功能（排斥与模板链不互补的碱基）功能（排斥与模板链不互补的碱基） • 与与Rho （（ρ））因子竞争因子竞争RNA 3’－－end E site（（elongation site RifR））:对对NTP非专一性地结非专一性地结 合（催化作用和合（催化作用和Editing功能）功能） （（4）） β’ 因子因子 • 参与参与RNA非模板链（非模板链（sense strand）的结合）的结合 （充当（充当SSB）） • 构成构成Holoenzyme 后，后，β因子含有两个位点因子含有两个位点 I site（（initiation site . Rifs））: 该位点专一性地结合该位点专一性地结合 ATP或者或者GTP （（需要高浓度的需要高浓度的ATP或或GTP））由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点由于各亚基的功能，使全酶本身含有五个功能位点Ø 有义有义DNA链结合位点（链结合位点（ β’亚基提供）亚基提供）Ø DNA/RNA杂交链结合位点（杂交链结合位点（β亚基提供亚基提供））Ø 双链双链DNA解链位点（前端解链位点（前端 α亚基提供亚基提供））Ø 单链单链DNA重旋位点（后端重旋位点（后端α亚基提供亚基提供））Ø σ因子作用位点因子作用位点E. coli RNA polymerase用于起始和延伸用于起始和延伸只用于起始只用于起始36.5 KD36.5 KD151 KD155 KD11 KD70 KD 二、启动子（二、启动子（promoter））的结构与功能的结构与功能 （（Prok.E.coli）） 1、、启动子由两个部分组成启动子由两个部分组成 （（1）） 上游部分上游部分 — CAP-cAMP结合位点结合位点 （基因表达调控的正控制位点）（基因表达调控的正控制位点） CAP（（catabolite gene Activator Protein）） 降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（降解物基因活化蛋白，环腺苷酸（cAMP））的受体蛋白的受体蛋白 （（2）） 下游部分下游部分 — RNApol的进入（结合）位点的进入（结合）位点 －－35 ~ －－10 包括识别位点和结合位点（包括识别位点和结合位点（R B位点）位点） 2、、 RNA聚合酶的进入位点聚合酶的进入位点 （（1）） Sextama 框（框（Sextama Box）） § -35序列，序列，RNA聚合酶的松弛（聚合酶的松弛（初始初始）结合位点，）结合位点， § RNA聚合酶依靠其聚合酶依靠其σ亚基识别该位点亚基识别该位点 —识别位点（识别位点（R位点）位点） § 大多数启动子中共有序列为大多数启动子中共有序列为 T82T84G78A65C54A45 § 重要性重要性:很大程度上决定了启动子的强度很大程度上决定了启动子的强度 （（RNApol 的的σ因子）因子） § 位置在不同启动子中略有变动位置在不同启动子中略有变动（（2）） Pribonow 框（框（Pribonow Box）） § -10序列，序列，RNA聚合酶的牢固结合位点聚合酶的牢固结合位点 结合位点（结合位点（B 位点）位点） § 一致序列：一致序列：T80A95T45A60A50T96 （（TATPUAT）） § 位置范围位置范围 －－4 到－到－13因此又称因此又称TATA Box保守保守T（（3）） 起始位点（起始位点（initiation site）：＋）：＋1位点位点 RNA聚合酶的转录起始位点聚合酶的转录起始位点 起始起始NTP多为多为ATP或或GTP 起始起始过程过程 ：： a. 全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成全酶与启动子结合的封闭型启动子复合物的形成 （（ R位点被位点被σ因子发现并结合因子发现并结合 ））  b、、 开放型启动子复合物的形成开放型启动子复合物的形成 § RNApol的一个适合位点到达－的一个适合位点到达－10序列区域，诱导富序列区域，诱导富 含含A·T的的Pribnow 框的框的“熔解熔解”，， 形成形成12－－17bp的泡的泡状状 物，同时酶分子向－物，同时酶分子向－10序列转移并与之牢固结合序列转移并与之牢固结合 § 开放型启动子复合物使开放型启动子复合物使RNApol聚合酶定向聚合酶定向 § 两种复合物均为二元复合物（两种复合物均为二元复合物（全酶和全酶和DNA ）） c. 在开放型的启动子复合物中，在开放型的启动子复合物中，RNApol的的I位点和位点和E位点的位点的 核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（核苷酸前体间形成第一个磷酸二酯键（ β 亚基）亚基） 三元复合物形成三元复合物形成 +1位多为位多为CAT模式模式,位于离开保守位于离开保守T 6~9 个核苷酸处个核苷酸处 ---6-9 bp--- GC T ATTGACATATAAT-----16-18 bp-------+1-35 sequence-10 sequence（（4）） σ因子解离因子解离 →核心酶与核心酶与DNA的亲和力下降的亲和力下降 起始过程结束起始过程结束→核心酶移动进入延伸过程核心酶移动进入延伸过程转录的起始过程转录的起始过程σ核心酶核心酶12～～17bp（（β亚基）亚基） 3、、 CAP-cAMP 结合位点结合位点 （也称（也称CAP位点）位点） 转录调控中，转录调控中，I → 阻遏蛋白阻遏蛋白 → 负调控负调控 lac 操纵子模型操纵子模型I 许多基因的表达还存在正调控机制许多基因的表达还存在正调控机制 例如例如: E.coli 培养基中乳糖和葡萄糖共存时培养基中乳糖和葡萄糖共存时 → 只有葡萄糖被只有葡萄糖被 利用利用 原因：原因：CAP位点的正调控位点的正调控 • 葡萄糖缺少时葡萄糖缺少时 ，腺苷酸环化酶将，腺苷酸环化酶将ATP → cAMP，， cAMP与与CAP位点结合位点结合,此时启动子的进入位点才能此时启动子的进入位点才能 与与RNApol结合结合 • 葡萄糖存在时，葡萄糖存在时，cAMP不能形成，没有不能形成，没有CAP－－cAMP 与与CAP位点结合，启动子的位点结合，启动子的RNApol进入位点不能结进入位点不能结 合合RNApol  因此因此,一个操纵元中有两道控制开关一个操纵元中有两道控制开关,只有同时打开只有同时打开,结构基因结构基因才才 能进行转录。

能进行转录对（对 lac操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）操纵元而言，只有没有葡萄糖，有乳糖时才能进行录）（（1））CAP位点的组成位点的组成 （－（－70 ～～ －－40）） 位点位点ⅠⅠ：－：－70 70 ～～ －－5050 包括一个包括一个IR 序列序列 强结合位点强结合位点 位点位点ⅡⅡ：－：－50 50 ～～ －－40 弱结合位点弱结合位点 位点位点ⅠⅠ对位点对位点ⅡⅡ具有协同效应（具有协同效应（cooperativity））（（2）） 位点位点ⅡⅡ结合结合CAP－－cAMP复合物后，促使复合物后，促使RNApol进入进入 Sextama Box,最终与－最终与－10序列结合起始转录序列结合起始转录 原因：原因：CAP－－cAMP复合物与位点复合物与位点ⅡⅡ结合结合 → Sextama Box 富含富含G·C区域（区域（G·C岛区）稳定性降低岛区）稳定性降低 → Pribnow Box 的溶解温度降低的溶解温度降低 →促进开放型启促进开放型启 动子复合物的形成动子复合物的形成 →促进转录促进转录上节课内容回顾上节课内容回顾:1、原核生物、原核生物RNApol：：2、原核启动子的结构：、原核启动子的结构： RNApol进入位点进入位点 起始过程起始过程 上游位点的组成和功能上游位点的组成和功能 4、、RNApol 在在DNA上结合位点的鉴定上结合位点的鉴定 DNase 法法----------40bp 而足迹法（而足迹法（footprinting））结果相对准确结果相对准确 足迹法原理：足迹法原理： • 限制酶切割结合有限制酶切割结合有RNApol的的DNA →大分子大分子DNA • 末端标记该末端标记该DNA（（Klenow片段标记片段标记3’,碱性磷酸酯碱性磷酸酯 酶标记酶标记5’）） • 用内切酶降解用内切酶降解DNA（（控制反应条件）控制反应条件） • 凝胶电泳分离，放射自显影观察凝胶电泳分离，放射自显影观察限制酶切限制酶切分离分离大片段大片段DNA末端标记大分子末端标记大分子DNA重新结合重新结合RNApol 作对照作对照直接用直接用DNase 进行降解进行降解电泳电泳用微量用微量DNase降解降解电泳电泳 • 用足迹法鉴定出来的用足迹法鉴定出来的 RNApol 与与DNA的结合区域为的结合区域为 +20 ~ －－50（－（－40），大约），大约 60 ~ 70 bp • 实验中还发现实验中还发现…………….. 5、、 启动子各位点与转录效率的关系启动子各位点与转录效率的关系 （（1）－）－35 序列与－序列与－10 序列与转录效率的关系序列与转录效率的关系 标准启动子标准启动子 －－35 TTGACA －－10 TATAAT 则不同的启动子则不同的启动子 a. 与标准启动子序列同源性越高与标准启动子序列同源性越高 →启动强度越大启动强度越大 b. 与标准启动子同源性越低与标准启动子同源性越低 →启动强度越小启动强度越小 c. 与标准启动子差异很大时与标准启动子差异很大时 →由另一种由另一种σ因子启动因子启动原因原因: • －－35序列通过被序列通过被 σ因子识别的容易因子识别的容易 → 决定启动子强度决定启动子强度 • －－10序列影响开放型启动子复合物形成的速度序列影响开放型启动子复合物形成的速度 → 决定启动子强度决定启动子强度  （（2）） －－35序列与－序列与－10序列的间隔区与转录效率的关系序列的间隔区与转录效率的关系 ◆◆ 碱基序列并不重要碱基序列并不重要 ◆◆ 间距非常重要间距非常重要，，17bp的间距转录效率最高的间距转录效率最高◆◆ 间距上的突变种类：间距上的突变种类： 间距趋向于间距趋向于17bp → 上升突变上升突变 间距远离间距远离17bp → 下降突变下降突变• 启动子上升突变、启动子下降突变启动子上升突变、启动子下降突变E.Coli各σ识别的启动子的序列识别的启动子的序列第三节第三节 真核生物真核生物RNA转录的启动转录的启动RNA Transcription promotion in Eukaryots 一、真核生物的一、真核生物的RNApol 1、、 三种三种RNApol：： 根据对根据对 α - 鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类鹅膏蕈碱的敏感性不同而分类 RNApolⅠⅠ 最不敏感最不敏感 （动、植、昆）（动、植、昆） RNApol ⅡⅡ 最敏感最敏感 RNApol ⅢⅢ 不同种类的敏感性不同不同种类的敏感性不同 2、、 位置和转录产物位置和转录产物 RNApolⅠⅠ 核仁核仁 活性所占比例最大活性所占比例最大 转录转录rRNA（（5.8S、、18S、、 28S））  RNApolⅡⅡ 核质核质 主要负责主要负责 hnRNA、、snRNA 的的转录转录 hnRNA（（mRNA 前体，核不均一前体，核不均一RNA heterogeneous nuclear RNA）） snRNA（（核内小分子核内小分子 RNA small nulear RNA) RNApol ⅢⅢ 核质核质 负责负责 tRNA、、5S rRNA、、Alu序列和序列和 部分部分 snRNA • 目前粒体和叶绿体内发现少数目前粒体和叶绿体内发现少数 RNApol（活性较低）（活性较低）3、亚基组成：、亚基组成： 分子量分子量500KDa,含两个大亚基和含两个大亚基和 7~12 个小亚基个小亚基 RNApolⅡⅡ：： • 大亚基中有大亚基中有 C 末端结构域末端结构域 (carboxy terminal domain CTD) • CTD中含一保守氨基酸序列的多个重复中含一保守氨基酸序列的多个重复 Tyr－－Ser－－Pro－－Thr－－Ser－－Pro－－Ser C 端重复七肽端重复七肽 • 不同生物中重复数目不一样（酶活性）不同生物中重复数目不一样（酶活性） • CTD中的中的 Ser和和 Thr可被高度磷酸化可被高度磷酸化 磷酸化的磷酸化的 RNApol ⅡⅡ被称为被称为ⅡⅡA 非磷酸化的非磷酸化的 RNApol ⅡⅡ称为称为ⅡⅡB • CTD参与转录参与转录 → ⅡⅡB → ⅡⅡA → 使使 RNApol易于离开易于离开 启动子进入延伸过程（启动子进入延伸过程（10倍）倍） 二、二、 真核生物的启动子真核生物的启动子 三种三种 RNApol → 三种转录方式三种转录方式 三种启动子三种启动子 → 三类基因，三类基因，ⅠⅠ类类 ⅡⅡ类类 ⅢⅢ类类 1、、 RNApolⅡⅡ的启动子的启动子 • 结构最复杂结构最复杂 • 位于转录起始点的上游位于转录起始点的上游,有多个短序列元件组成有多个短序列元件组成 • 通用型启动子（无组织特异性）通用型启动子（无组织特异性） （（1）） 帽子位点（帽子位点（cap site）：）：转录起始位点转录起始位点 与与Prok.的的“CAT模式模式”相似相似 （（2）） TATA框（框（Hogness 框框或或 Goldberg-Hogness 框框）） • 位于－位于－30处处 • 一致序列为一致序列为T82A97T93A85A63（（T37））A83A50（（T37））  • 定位转录起始点的功能定位转录起始点的功能 （类似原核的（类似原核的Pribnow框）框） • TATA是绝大多数真核基因的正确表达所必需的是绝大多数真核基因的正确表达所必需的（（3）） CAAT框（框（CAAT box）） • 位于－位于－75bp处处 • 一致序列为一致序列为GGC/TCAATCT • 前两个前两个 G 的作用十分重要的作用十分重要(转录效率转录效率) • 增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性增强启动子的效率、频率，不影响启动子的特异性 （距转录起始点的距离，正反方向）（距转录起始点的距离，正反方向） ☻ 以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在以上三个保守序列在绝大多数启动子中都存在 （（4）） 增强子（增强子（enhancer）） （（又称远上游序列又称远上游序列 far upstream sequence）） • 在－在－100以上以上 • SV40的两个正向重复研究得最清楚（的两个正向重复研究得最清楚（DR）） -107~178 、－、－179 ~ －－250 各各 72bp • 该增强子的特点如下：该增强子的特点如下： ♪ 对依赖于对依赖于TATA框的转录的增强效应高于不依赖框的转录的增强效应高于不依赖 的情况的情况 ♪ 距离效应距离效应: 离离72bp越近的容易起始转录越近的容易起始转录 ♪ 转录方向离开转录方向离开72bp的起始序列优先转录的起始序列优先转录 ♪ 细胞类型的选择：不同类型中作用有差异细胞类型的选择：不同类型中作用有差异 表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）表明其作用具有细胞或组织特异性（调节蛋白）（（5）） GC框框 （（GC box）） • 位于－位于－90附近，较常见的成分附近，较常见的成分 • 核心序列为核心序列为GGGCGG • 可有多个拷贝，也可以正反两方向排列可有多个拷贝，也可以正反两方向排列（（6）其他元件）其他元件 • 八聚核苷酸元件八聚核苷酸元件（（octamer element OCT元件元件）） 一致序列为一致序列为 ATTTGCAT • KB元件元件 一致序列为一致序列为 GGGACTTTCC • ATF元件元件 一致序列为一致序列为 GTGACGT • 还有一些位于起始点下游的相关元件还有一些位于起始点下游的相关元件（（7）） 不同元件的组合情况不同元件的组合情况 不同元件的不同元件的数目、位置、和排列方向数目、位置、和排列方向均有差异均有差异 例如：例如：SV40的早期启动子中有的早期启动子中有6个个GC框框小结小结：： ★ ★ 不同启动子中不同启动子中每种元件与转录起始点的距离不同每种元件与转录起始点的距离不同 ★★ 不同启动子中的相应元件互相交换不同启动子中的相应元件互相交换,形成的杂交形成的杂交 启动子功能没有变化启动子功能没有变化 ★★ 各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上，各种元件将相应的蛋白因子结合到启动子上， 组成起始复合物，组成起始复合物，蛋白因子间的相互作用决定蛋白因子间的相互作用决定 了转录的起始了转录的起始 2、、 RNApol ⅢⅢ启动子结构启动子结构 （（1）） 分为三类，每种识别方式不同分为三类，每种识别方式不同 a、、 下游启动子（内部启动子）下游启动子（内部启动子） 位于转录起始点的下游位于转录起始点的下游 5SRNA 和和 tRNA基因基因 可分为两类可分为两类 b、、 上游启动子上游启动子 snRNA（（2）内部启动子的发现）内部启动子的发现 最早发现于非洲爪蟾的最早发现于非洲爪蟾的5S rRNA基因基因 试验设置：试验设置： ★★ 非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系，非洲爪蟾的卵母细胞提取液作为体外转录体系， 进行缺失试验进行缺失试验 ★★ 以不同长度的以不同长度的5S rRNA基因为模板进行转录基因为模板进行转录 结果：结果： ★★ 缺失＋缺失＋55以前和缺失＋以前和缺失＋80以后的序列都能正常转录以后的序列都能正常转录 ★★ 缺失＋缺失＋55到＋到＋80序列不能转录序列不能转录 结论：结论： ★★ 5S rRNA基因的启动子位于基因内部基因的启动子位于基因内部 ★★ 该启动子可使该启动子可使RNApolⅢⅢ在其上游的在其上游的55bp处起始转录处起始转录（（3）） 内部启动子分为两类内部启动子分为两类 均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开均含两个短序列元件，中间由其他序列隔开 第一类：第一类： 含含A框和框和C框框 （（5S rRNA基因）基因） 第二类：第二类： 含含A框和框和B框框 （（tRNA基因、基因、VARNA基因）基因） 间隔序列长短差异很大间隔序列长短差异很大 ☻ 其中内部启动子起被其中内部启动子起被 RNApolⅢⅢ 识别的作用识别的作用上节课内容回顾上节课内容回顾:1、、RNApol在在DNA上结合位点的鉴定上结合位点的鉴定2、启动子的各部位与转录效率的关系、启动子的各部位与转录效率的关系3、真核生物、真核生物RNApol：： 种类及各自转录的基因种类及各自转录的基因 亚基组成亚基组成4、、RNApolⅡⅡ的启动子的启动子5、、RNApolⅢⅢ的启动子的启动子 三、三、 真核生物转录的起始真核生物转录的起始 ♫ 三种三种RNApol均没有对启动子特异序列的识别能力均没有对启动子特异序列的识别能力 ♫ 转录起始过程需要很多的辅助因子转录起始过程需要很多的辅助因子(转录因子转录因子)参与参与, 并且按一定顺序与并且按一定顺序与DNA形成复合物形成复合物,协助协助RNApol定定 位于转录起始点位于转录起始点RNApol ⅠⅠTBP因子因子RNApol ⅡⅡ ★ ★ RNApol ⅢⅢ的转录起始的转录起始 ◎◎ 两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子两种内部启动子的转录起始需要三种辅助因子 TFⅢⅢA 一种含锌指结构的蛋白一种含锌指结构的蛋白 TFⅢⅢB 由由TBP和和BRT、、B” TFⅢⅢC 至少至少5个亚基以上个亚基以上 ☻ TBP 的作用的作用 ★★ 所有所有 RNApolⅢⅢ 的转录起始都需要的转录起始都需要TBP ★★ 在在 RNApolⅠⅠ的转录起始过程中的转录起始过程中,TBP是是SL1的的 组份，起定位组份，起定位RNApolⅠⅠ的作用的作用 ★★ RNApolⅡⅡ的转录起始由的转录起始由TBP识别识别TATA框框 ☻ TBP 起定位作用起定位作用,所以又称定位因子所以又称定位因子 （（positioning factor））第四第四节节 转录转录延伸延伸 Transcription Elongation 一、一、 起始到延伸的转变起始到延伸的转变 ★★ 始于第一个磷酸二酯键的形成始于第一个磷酸二酯键的形成 ★★ 伴随着伴随着DNA分子和酶分子构象的变化分子和酶分子构象的变化 1、、Prok. • 起始时，起始时， σ因子有利于因子有利于β 和和 β’亚基具有与亚基具有与DNA专一专一 性结合所要求的构象性结合所要求的构象 • 起始后起始后, σ因子解离因子解离, β 和和 β’ 亚基构象发生变化亚基构象发生变化 2、、 Euk. • 多种辅助因子的共同作用来保证这一转变多种辅助因子的共同作用来保证这一转变 二、二、 延伸过程（延伸过程（Prok）） ★ ★ 酶与产物酶与产物RNARNA不解离不解离 ★ ★ 底物底物NTPNTP不断加到不断加到RNARNA链的链的 3’-OH 3’-OH 端端 ★ ★ 形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动形成一个磷酸二酯键后，核心酶向前滑动 ★ ★ 延伸位点不断地接受新的延伸位点不断地接受新的NTPNTP，，RNARNA链不断延伸链不断延伸 ☻ 始终保持三元复合物的结构始终保持三元复合物的结构 1、、 转录泡转录泡 ★★ RNApol 结合和转录的结合和转录的DNA模板区域，有模板区域，有17bp左右左右 DNA形成解链区形成解链区 ★★ 转录泡处杂交双链很短转录泡处杂交双链很短 • 胰脏胰脏 RNAase______其长度其长度10bp（（不准确）不准确） • 推测也就两个核苷酸左右推测也就两个核苷酸左右 2、、 拓扑学问题拓扑学问题 ΦΦ RNA合成过程中，转录泡两端要发生拓扑转变合成过程中，转录泡两端要发生拓扑转变 • RNApol 的前沿的前沿…..解螺旋作用解螺旋作用 • RNApol 后端后端…..DNA的螺旋化的螺旋化 （保持（保持…………）） ΦΦ 超缠问题的解决靠超缠问题的解决靠DNA旋转酶旋转酶 Φ RNA-DNA杂交链也要求作旋转运动杂交链也要求作旋转运动旋转酶旋转酶 3、、 转录过程中的延宕转录过程中的延宕 （（1）） RNA的合成速度大约的合成速度大约 30 ~ 50 个核苷酸／秒个核苷酸／秒,与蛋白与蛋白 质的合成速度相近（质的合成速度相近（15个个AA／／sec）） （（2）） 模板模板DNA中中G／／C 的存在的存在 延宕延宕 （（G／／C后的后的 8~10 个核苷酸）个核苷酸） 延宕作用在延宕作用在RNA链的终止和释放中起重要作用链的终止和释放中起重要作用思考思考: 延宕发生的原因延宕发生的原因? 第五节第五节 转录的终止转录的终止 Transcription termination ☆ ☆ 终止过程：终止过程： 酶停止添加底物酶停止添加底物→→→→释放释放RNA链链→→→→酶解离酶解离 终止反应终止反应…杂合双链的氢键断裂，杂合双链的氢键断裂， …重新形成双螺旋，酶的解离。

重新形成双螺旋，酶的解离☆☆ 终止子（终止子（terminator）：）：在转录的过程中，提供转录终止在转录的过程中，提供转录终止 信号的信号的RNA序列序列 真正起终止作用的是真正起终止作用的是RNA序列－－－与启动子不同序列－－－与启动子不同☆☆ Prok.和和Euk. 都具有－－－－一种基因表达调控的手段都具有－－－－一种基因表达调控的手段 一、原核生物的终止子一、原核生物的终止子 1、、 终止子的种类终止子的种类 （（1）） 内在终止子（不依赖内在终止子（不依赖 ρ因子的终止子）因子的终止子） 体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止体外实验中，只有核心酶和终止子就足以使转录终止 （（2）） 依赖依赖ρ因子的终止子因子的终止子 蛋白质辅助因子－－蛋白质辅助因子－－ρ因子因子存在时，核心酶终止转录存在时，核心酶终止转录 两者有共同的结构特征（序列差异）两者有共同的结构特征（序列差异）2、不依赖、不依赖 ρ因子的终止子因子的终止子 结构特征结构特征: ☻ 一是形成一个发夹结构一是形成一个发夹结构 茎茎…. 7~20 bp的的IR序列形成（富含序列形成（富含G/C）） 环环….中间不重复序列形成中间不重复序列形成 发夹结构的突变可阻止转录的终止发夹结构的突变可阻止转录的终止 ☻ 二是二是6 ~ 8 个连续的个连续的U串（发夹结构末端）串（发夹结构末端）不依赖不依赖ρρ终止子结构终止子结构IRIR茎部富含茎部富含GC3、依赖、依赖 ρ因子的终止子因子的终止子 （（1）） 结构结构 IR序列中的序列中的 G／／C 对含量较少对含量较少 发夹结构末端没有固定特征发夹结构末端没有固定特征 （（2）） 靠与靠与ρ的共同作用而实现终止的共同作用而实现终止 无连续无连续 U串串G/C含含量量较较少少 二、二、 原核生物转录的终止原核生物转录的终止 1、不依赖、不依赖ρ因子的终止子终止转录因子的终止子终止转录 （（1）） 新生新生RNA链发夹结构形成链发夹结构形成 与与RNApol发生作用发生作用 造成高度延宕（典型的有造成高度延宕（典型的有60秒左右）秒左右） （（2）） RNApol暂停为终止提供了机会暂停为终止提供了机会 ，，6 ~ 8个连续的个连续的U 串可能为串可能为RNApol与模板的解离提供了信号与模板的解离提供了信号 RNA－－DNA之间的之间的 rU－－dA 结合力较弱结合力较弱 阻止阻止RNA链的释放链的释放 于是：于是： RNA－－DNA解离解离 三元复合体解体三元复合体解体 RNApol解离解离 转录终止转录终止（（3）） 真正的终止点不固定，在真正的终止点不固定，在 U串中的任何一处串中的任何一处（（4）） IR序列和序列和U串同等重要串同等重要 IR中的中的G／／C对含量的减少对含量的减少 U串的缩短或缺失串的缩短或缺失（（5）） DNA上与上与U串对应的为富含串对应的为富含A／／T的区域的区域 说明：说明：AT富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用富含区在转录的终止和起始中均起重要的作用 2、依赖、依赖 ρ因子的终止子终止转录因子的终止子终止转录 （（1）） 通读（通读（read through）：）：在依赖在依赖 ρ 因子的转录终止因子的转录终止 过程中，过程中， RNApol 转录了转录了 IR 序列之后，虽发生序列之后，虽发生 一定时间的延宕，但如果没有一定时间的延宕，但如果没有 ρ 因子存在，则因子存在，则 RNApol 会继续转录会继续转录 （（2）） ρ因子因子 a、、 活性形式为六聚体活性形式为六聚体 促进转录终止的活性，促进转录终止的活性，NTPase 活性活性 b、、 RNA长度大于长度大于50nt时，依赖时，依赖RNA的的NTPase活性最大活性最大 说明：说明：ρ因子识别和结合的是因子识别和结合的是RNA（（3）） ρ因子对终止子的作用因子对终止子的作用 a、、ρ因子与因子与RNA结合（终止子上游的某一处，结合（终止子上游的某一处，RNA的的5’端端 ）） b、、ρ因子沿因子沿RNARNA从从5’5’→3→3’’移动（移动（NTPNTP水解供水解供能能）） （终止子处的较长时间的延宕给（终止子处的较长时间的延宕给ρ因子追赶的机会因子追赶的机会））c c、、ρρ因子与因子与 RNApolRNApol 相互作用而造成转录的终止相互作用而造成转录的终止ρ结合上来追赶结合上来追赶RNApolρ追赶上来追赶上来（暂停）（暂停） ρ与与RNApol相相互作用使杂交链互作用使杂交链解链解链终止子终止子 （（4）） 终止反应还需要终止反应还需要 RNA 与与 DNA 的相互作用的相互作用 即即 ：： 需要一定的需要一定的RNA序列序列 因为：因为： 其其与模板的结合力必须弱到一定数值与模板的结合力必须弱到一定数值，才能配合，才能配合 ρ因子因子与与 RNApolRNApol 的作用的作用 （发夹结构下游的（发夹结构下游的AUAU序列）序列） 序列不同的终止子序列不同的终止子→→→→不同的终止程度不同的终止程度→→→→基因表达基因表达 调控的途径之一调控的途径之一（（5 5）） Prok.依赖依赖ρρ因子的终止子为基因表达调控因子的终止子为基因表达调控 提供了一种方式提供了一种方式 因为：因为： Prok. .中转录与翻译偶联中转录与翻译偶联 ？？？？为什么同一个转录元里近基因的一个无义为什么同一个转录元里近基因的一个无义 突变能阻止远基因的表达这一极性现象突变能阻止远基因的表达这一极性现象RNApol核糖体核糖体ρ因子因子无义突变无义突变位点位点三、终止与抗终止及抗终止因子三、终止与抗终止及抗终止因子♦ 各种生物采用不同的手段控制不同发育阶段各种生物采用不同的手段控制不同发育阶段 的基因表达的基因表达 * 枯草杆菌枯草杆菌------更替更替σ因子因子 * T7噬菌体噬菌体------更换更换RNApol * λ噬菌体采用噬菌体采用依赖于依赖于ρ因子的终止以及通过抗因子的终止以及通过抗 终止因子的抗终止作用终止因子的抗终止作用λPhage的的操操纵纵元元组组织织情情况况PMPLPRPR’重重组组复制复制裂裂解解溶原周期溶原周期溶菌周期溶菌周期PNPQ抗终止作用的过程抗终止作用的过程早期早期迟早期迟早期晚期晚期♫ 抗抗终止的机制止的机制•依赖于噬菌体本身的依赖依赖于噬菌体本身的依赖ρ因子的因子的终终止子止子•依赖依赖ρ因子的因子的终终止子上游有抗止子上游有抗终终止信号止信号(靠近靠近PL 的的nutL，靠近，靠近tR1的的nutR nut—PN utilization)•抗抗终终止蛋白和止蛋白和nut位点的位点的结结合，等待合，等待RNApol经过经过 时时修修饰饰RNApol的构象，拮抗寄主的构象，拮抗寄主编码编码的的终终止蛋白止蛋白ρ的活性的活性,使之通使之通过过那些依那些依赖赖ρ的的终终止子止子上节课内容回顾上节课内容回顾:1、转录的延伸、转录的延伸2、转录的终止、转录的终止 不依赖不依赖ρρ因子的终止子终止转录因子的终止子终止转录 依赖依赖ρρ因子的终止子终止转录因子的终止子终止转录3、抗终止、抗终止 四、真核生物的终止子及转录终止四、真核生物的终止子及转录终止 了解很少（了解很少（3’ 末端）末端） 1、、 RNApolⅡⅡ的终止子类似的终止子类似ProkProk. .不依赖不依赖ρρ因子因子终止子，终止子， 终止可能靠终止可能靠RNApolⅡⅡ本身完成本身完成 • SV40的终止子的终止子: 发夹结构发夹结构 U串串 2、、 RNApolⅢⅢ的终止子类似原核生物（发夹结构的终止子类似原核生物（发夹结构 U串）串） • U串位于发夹结构的顶端串位于发夹结构的顶端 • 且保守性很强（酵母且保守性很强（酵母→→人）人） • 环和柄对转录的终止同等重要环和柄对转录的终止同等重要 第六节第六节 原核生物转录产物的后加工原核生物转录产物的后加工Pre-RNA processing in Prokaryotes ΦΦ Prok.的的mRNA半衰期只有几分钟半衰期只有几分钟 （基因表达调控的一种手段）（基因表达调控的一种手段） ΦΦ rRNA、、tRNA比较稳定比较稳定 半衰期几小时半衰期几小时 成熟分子和转录产物的差别：成熟分子和转录产物的差别： • • 5 5’’单磷酸／三磷酸单磷酸／三磷酸 • • 分子大小分子大小 • • 异常碱基异常碱基 一、一、 rRNA 后加工后加工 1、、 基因排列方式基因排列方式 ★★ 三种三种 rRNA 基因（基因（5S、、16S、、23S））与与tRNA 的基因形成操纵元（的基因形成操纵元（rrn）（）（E.coli 七个）七个） ★★ 每个每个rrn中中 tRNA 基因无固定模式基因无固定模式 （种类、数量、位置）（种类、数量、位置） ★★ 三个三个rRNA基因的相对位置有一定规律基因的相对位置有一定规律 …16S rDNA……间隔间隔 tDNA…….23S rDNA…….5S rDNA……收尾收尾 tDNA…加工过程主要是加工过程主要是RNAseⅢⅢ等酶的作用等酶的作用双链区域双链区域 二、二、 tRNA的转录后加工的转录后加工 1、、tRNA 基因基因 （（1）） 转录单元大多是多基因的转录单元大多是多基因的 同一个同一个tRNA基因、不同基因、不同tRNA基因、基因、 与与rRNA基因基因 （（2）） 有两种类型的有两种类型的 tRNA 基因：基因： ⅠⅠ型型 具有具有3’端的端的CCA序列序列 ⅡⅡ型型 没有没有3’端的端的CCA序列序列 （（3）） ⅠⅠ型型需在酶的作用下切除需在酶的作用下切除CCA下游一段序列下游一段序列 （（Prok. 的的tRNA多为多为ⅠⅠ型）型） ⅡⅡ型需要在酶的作用下添加型需要在酶的作用下添加CCA序列序列 （（少数少数 Phage 、、 Euk.）） 2、、 参与参与 tRNA后加工的酶后加工的酶 （（1）） RNAaseP：： 内切核酸酶，核蛋白内切核酸酶，核蛋白 使使 tRNA产生成熟的产生成熟的 5’端端 识别识别tRNA的空间构象的空间构象 （（2）） RNAaseD：：外切核酸酶，使外切核酸酶，使ⅠⅠ型型 tRNA暴露出暴露出CCA端端 a、、 RNAaseP 存在时存在时 RNAaseD可达最大活性可达最大活性 b、、 RNAaseQ、、RNAaseY、、RNAaseP3与此酶功能相同与此酶功能相同（（3）） tRNA核苷酸转移酶（核苷酸转移酶（tRNA nucleotidyl transferase）） 以以ATP和和CTP为前体，催化为前体，催化 tRNA（（ⅡⅡ型型）的）的3’端生成端生成CCA a、、 E.coli中该酶基因突变后，会影响菌株生长中该酶基因突变后，会影响菌株生长 （（CCA末端常丢失）末端常丢失） b、、 识别识别tRNA的空间结构，无种属特异性的空间结构，无种属特异性（（4）） RNAase ⅢⅢ：与：与RNAaseO、、RNAaseP2的功能相似，负责切的功能相似，负责切 开间隔序列开间隔序列3、、E.coli 的的 tRNATyr1分子的修饰过程分子的修饰过程 编码基因的原始转录物编码基因的原始转录物三磷酸三磷酸 有两个基因拷贝有两个基因拷贝 间隔子间隔子（各长（各长350base））有一个有一个tRNATyr1的转录单元的原始转录物的修饰过程的转录单元的原始转录物的修饰过程①①②②③③④④⑤⑤⑤⑤⑤⑤⑤⑤三、三、RNA中的甲基化及常见的修饰核苷酸中的甲基化及常见的修饰核苷酸 m5C m6A HNHHNHOO HNH HN— CH3H3C★★ Prok.中主要是碱基的修饰中主要是碱基的修饰 Euk.－－核糖、碱基－－核糖、碱基常见常见tRNA中的修饰核苷酸中的修饰核苷酸 Cmnm5U (5-羧甲基氨甲基尿苷羧甲基氨甲基尿苷)mCm5U （（5-甲氧基羰甲基尿苷）甲氧基羰甲基尿苷）Xm5s2U （（5-甲基甲基-2硫代尿苷）硫代尿苷）K2C （（2-赖氨酸胞苷）赖氨酸胞苷）Com5U （（5(2)-羟羧甲基尿苷）羟羧甲基尿苷）I （（Inosine次黄嘌呤）次黄嘌呤）m7G (7-甲基尿苷甲基尿苷)m5C （（5-甲基胞苷）甲基胞苷）m6A （（6-甲基腺苷）甲基腺苷）s2C （（2-硫代胞苷）硫代胞苷）ψ (假尿苷）假尿苷）Um (2’-O-甲基尿苷甲基尿苷)Q （（Queuosine）） Xo5U (5-羟基尿苷羟基尿苷) OH OH NH CH2 H2N R 第七节第七节 Euk转录产物的后加工转录产物的后加工 Pre-RNA processing in Eukaryotes 一、一、rRNA的转录后加工的转录后加工 主体主体rRNA基因（基因（5.8S、、18S、、28SrDNA）组成一个转录单元）组成一个转录单元47S前体前体45S前体前体 a、、甲基化位点可能是酶识别的标志甲基化位点可能是酶识别的标志 b、、加工的对象是一种核蛋白加工的对象是一种核蛋白 c、、哺乳动物的哺乳动物的45SRNA前体有几种不同的加工方式前体有几种不同的加工方式二者的共同之处二者的共同之处: • 先切除先切除18S rRNA之前之前5’端序列端序列 • 18S rRNA部分与后面的部分与后面的5.8S rRNA和和28S rRNA 部分分开部分分开 • 5.8S rRNA和和 28S rRNA通过碱基配对相结合通过碱基配对相结合☀￿￿☀￿￿Euk.的的 5S rRNA二、二、mRNA的转录后修饰的转录后修饰－－--------帽子帽子 1、、 帽子的种类帽子的种类 帽子帽子0（（Cap-0）） m7GpppXpYp----------（（共有）共有） m7G N7—甲基鸟苷甲基鸟苷 帽子帽子1 （（Cap-1）） m7GpppXmpYp---------- 第一个核苷酸的第一个核苷酸的 2’-O 位上产生甲基位上产生甲基 化化 （（A N6 位甲基化）位甲基化） 帽子帽子2（（Cap-2）） m7GpppXmpYmp 第二个核苷酸的第二个核苷酸的 2’-O 位上产生甲基位上产生甲基 化（化（A、、G、、C、、U））HN—CH3m7G帽子帽子0其中其中: ☆☆ 单细胞真核生物只有单细胞真核生物只有 Cap—0 ☆☆ Cap—1 是其余真核生物的主要帽子形式是其余真核生物的主要帽子形式 ☆☆ Cap—2 存在于某些真核生物中存在于某些真核生物中2、、 帽子结构的生成帽子结构的生成 ☆☆ 甲基供体都为甲基供体都为S—腺苷甲硫氨酸（腺苷甲硫氨酸（SAM）） ☆☆ RNA鸟苷酸转移酶鸟苷酸转移酶-----戴帽酶（戴帽酶（capping enzyme）） 3、、 帽子结构的功能帽子结构的功能 （（1）） 对翻译起识别作用对翻译起识别作用------为核糖体识别为核糖体识别RNA提供信号提供信号 Cap—0 的全部都是识别的重要信号的全部都是识别的重要信号 Cap—1,2 的甲基化能增进识别的甲基化能增进识别 （（2）） 增加增加mRNA 的稳定性，使的稳定性，使5’端免遭外切核酸酶的攻击端免遭外切核酸酶的攻击 （（3）） 与某些与某些RNA病毒的正链合成有关病毒的正链合成有关 （（Cap—1、、 Cap—2 ）） 除帽子结构外的除帽子结构外的Euk.mRNA内部甲基化－－－内部甲基化－－－m6A形式形式三、三、mRNA的转录后修饰的转录后修饰二二-------- 多聚（多聚（A）尾）尾巴巴 1、、 3’端端-----约长约长200bp (大多数大多数Euk.的的mRNA) （（poly(A)+ poly(A)- ）） 最近研究发现，原核生物的最近研究发现，原核生物的RNA转录后也有转录后也有3’添加添加 poly(A) 的现象的现象 E.coli 的的poly(A)+聚合酶早在聚合酶早在1962年就已发现年就已发现 2、、 poly(A) 的生成的生成 a、、 RNA末端腺苷酸转移酶（末端腺苷酸转移酶（poly(A) 聚合酶聚合酶）催化）催化 前体－－前体－－ATP反应如下：反应如下： 多聚核糖核酸多聚核糖核酸 + nATP Mg++ 或或 Mn++ 多聚核糖核酸多聚核糖核酸(A)n + nPPi b、、添加位点添加位点 内切酶内切酶(360KDa)切除一段序列切除一段序列 由由poly(A) 聚合酶聚合酶 催化添加催化添加poly(A)内切酶的识别位点（有其它因子参与）内切酶的识别位点（有其它因子参与） 切点上游切点上游 13－－20bp处的处的 AAUAAA 切点下游的切点下游的 GUGUGUG （（单细胞单细胞Euk.除外）除外）上节课内容回顾上节课内容回顾:1、、Prok.转录产物的后加工转录产物的后加工 rRNA tRNA2、、Euk.转录产物的后加工转录产物的后加工尾巴的生成尾巴的生成主体主体rRNA帽子结构帽子结构 3、、 poly(A) 的功能的功能 c、、对含对含 poly(A) 的的mRNA 失去失去 poly(A) 可减弱其翻译可减弱其翻译 （（1）） 可能与核质转运有关可能与核质转运有关）） （（2）） 与与mRNA的寿命有关的寿命有关 （（3）） 与翻译有关与翻译有关 a、、 缺失可抑制体外翻译的起始缺失可抑制体外翻译的起始 b、、 胚胎发育中，胚胎发育中，poly(A) 对其对其mRNA的翻译有影的翻译有影 响（非响（非poly(A) 化的为储藏形式）化的为储藏形式）（（4）） poly(A) 在分子生物学实验中有很大应用价值在分子生物学实验中有很大应用价值 a、、 也可将也可将 oligo (dT) 与载体相连，从总体与载体相连，从总体RNA中分离中分离 纯化纯化mRNAb、、 用寡聚用寡聚dT（（oligo (dT)））为引物，反转录合成为引物，反转录合成 cDNA  第八第八节节 Euk.转录产转录产物中物中内内元的去除元的去除Intron removing in Eukaryote一、概述一、概述 1、、 概念概念 割裂基因（割裂基因（split gene）：）：指编码某一指编码某一RNA的基因中有些的基因中有些 序列并不出现在成熟的序列并不出现在成熟的RNA序列中，成熟序列中，成熟RNA 的序列在基因中被其他的序列隔开的序列在基因中被其他的序列隔开 内元（内元（intron）：原初转录物中通过）：原初转录物中通过RNA拼接反应而被去拼接反应而被去 除的除的RNA序列或基因中与这些序列或基因中与这些RNA序列相应的序列相应的 DNA序列序列 外元（外元（excon）：）：  RNA拼接（拼接（RNA splicing）：）：一个基因的外元和内元共同一个基因的外元和内元共同 转录在一条转录产物中，将内元去除而把外元连转录在一条转录产物中，将内元去除而把外元连 接起来形成成熟接起来形成成熟RNA分子的过程分子的过程 拼接点：拼接点： 5’ 拼接点或左拼接点（内元上游）拼接点或左拼接点（内元上游） 3’ 拼接点或右拼接点（拼接点或右拼接点（……下游）下游）2、、 内元的分类内元的分类 1982 Davies等人等人 中部核心结构（中部核心结构（central core structure））:在有些内元在有些内元 中，含有中，含有4个重复的保守序列，长度为个重复的保守序列，长度为 10 ~ 20bp，，4个保守序列构成一种二级个保守序列构成一种二级 结构，在拼接中起重要作用结构，在拼接中起重要作用 由于并非所有的内元都有中部核心结构，所以有了内元的分类由于并非所有的内元都有中部核心结构，所以有了内元的分类 ★ ★ ⅠⅠ类内元（类内元（group group ⅠⅠ））: :含有中部核心结构的含有中部核心结构的 细胞器基因细胞器基因 核基因核基因 ★★ ⅡⅡ类内元（类内元（group ⅡⅡ））:不含有中部核心结构不含有中部核心结构 细胞器线粒体基因内细胞器线粒体基因内 核基因核基因 ★★ ⅢⅢ类内元类内元 （（group ⅢⅢ））:具有具有 GU－－AG 特征的边界序列特征的边界序列 核基因核基因mRNA前体前体 ★★ tRNA基因的内元基因的内元 均位于均位于 tRNA 的反密码环上的反密码环上四种内元的边界序列各有一定共同的特征四种内元的边界序列各有一定共同的特征3、拼接方式、拼接方式 方式一：由拼接装置完成（核方式一：由拼接装置完成（核mRNA内元）内元） 可供识别的特异序列可供识别的特异序列 拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成拼接装置由多种蛋白质和核蛋白组成 方式二：自我拼接（两类内元方式二：自我拼接（两类内元ⅠⅠ 、、ⅡⅡ ）） 形成特定的二级结构形成特定的二级结构 RNA具有催化拼接的能力具有催化拼接的能力 方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母方式三：需要蛋白质酶参与的拼接（酵母tRNA）） 前两种拼接都属于转酯反应前两种拼接都属于转酯反应二、二、tRNA的拼接（酵母为例）的拼接（酵母为例） 1、链的断裂和连接是两个独立的过程、链的断裂和连接是两个独立的过程 2、、tRNA的内元均的内元均位于反密码环的位于反密码环的3’端，与反密码子相距端，与反密码子相距 一个一个Nt（（40／／400）） 长长14~16bp，，其中含一段与反密码环互补的序列其中含一段与反密码环互补的序列 反密码环处形成一个与成熟反密码环处形成一个与成熟tRNA不同的构象不同的构象 3、拼接酶系识别的是二级结构、拼接酶系识别的是二级结构酵母酵母tRNAphe 4、、 拼接过程拼接过程 研究方法研究方法 构建温度敏感突变体（高温时构建温度敏感突变体（高温时……………..））分离累积分离累积tRNA前体前体体外加入野生型细胞抽提液体外加入野生型细胞抽提液研究研究拼接过程拼接过程 第一步：第一步：内切酶作用内切酶作用 释放一条线状内元分子释放一条线状内元分子和两个和两个“tRNA半分子半分子”两个两个tRNA半分子采取成熟半分子采取成熟tRNA分子的构象分子的构象(切刻切刻) 第二步：第二步： RNA连接酶连接断端连接酶连接断端 其中其中 内切酶作用后产生内切酶作用后产生 5’OH 和和 3’磷酸，磷酸，3’磷酸端很快转磷酸端很快转 变为变为2’，，3’环式核苷酸环式核苷酸 因此，因此，一个半分子有两个磷酸末端，一一个半分子有两个磷酸末端，一 个半分子有两个个半分子有两个 －－OH末端末端连接反应前要进行两个反应：连接反应前要进行两个反应： a、左外元的、左外元的3’端成为端成为OH （环式磷酸二酯酶）（环式磷酸二酯酶） 其其 3’ 位为位为OH，， 2’ 位为磷酸位为磷酸b、第二个外元的、第二个外元的 5’端转变为端转变为 磷酸基磷酸基（多聚核苷酸激酶）（多聚核苷酸激酶）因此因此 ΦΦ 连接后还要切除第一个外元的连接后还要切除第一个外元的 2’—磷酸磷酸 这是这是 tRNA内元拼接重要特点之一内元拼接重要特点之一前体前体RNA两个半分子两个半分子进行两个进行两个连接反应连接反应成熟成熟tRNA 三、第三、第 ⅠⅠ类内元的拼接类内元的拼接 特点：特点： ø 拼接属于自我拼接拼接属于自我拼接 ø 形成明显的二级结构形成明显的二级结构 1 1、、 结构特点：结构特点： （（1 1）） 5’ 5’ 拼接点和拼接点和3’ 3’ 拼接点拼接点-------U↓… …G ↓ ↓ ↓ 5’ ……exon……U……intron……G……exon……3’ （（2 2）） 有由保守序列形成的二级结构有由保守序列形成的二级结构 a a、、 保守序列为保守序列为 5’ －－P－－Q－－R－－S－－3’ 距拼接点很远，各距拼接点很远，各 10~12bp P与与Q互补、互补、R与与S互补而形成中部核心结构互补而形成中部核心结构 b、、 二级结构中还包括内元与外元的某一序列互补所形成二级结构中还包括内元与外元的某一序列互补所形成 的二级结构的二级结构 内部引导序列（内部引导序列（interal guide sequence IGS）：内）：内 元中能与两个拼接点边界序列配对的一元中能与两个拼接点边界序列配对的一 段序列段序列 # 第一类内元的拼接依赖于以上二级结构第一类内元的拼接依赖于以上二级结构 －－为自我拼接的进行提供活性位点－－为自我拼接的进行提供活性位点 2、、 拼接机制（以四膜虫的大拼接机制（以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例）前体的拼接为例） （（1）） 两种两种rRNA转录在一条转录在一条35S的产物中，的产物中，26SrRNA 有内元有内元 5’ U G 3’ 小小rRNA 大大rRNA（（26S 有内元）有内元） （（2）） 35SRNA体外有自我拼接的能力体外有自我拼接的能力 反应需要：一价和二价离子反应需要：一价和二价离子 鸟苷酸辅助因子（鸟苷酸辅助因子（GTP GDP GMP和和 鸟嘌呤核苷）鸟嘌呤核苷） 不需能量的供给不需能量的供给 （（3）） 拼接反应后，拼接反应后，G与内元（与内元（414base）） 5’端以磷酸二酯端以磷酸二酯 键相连键相连 （放射性标记试验）（放射性标记试验） （（4）） 具体的拼接过程具体的拼接过程 第一步：第一步： 游离游离G发动的转酯反应发动的转酯反应 G 的的 3’-OH 攻击内元的攻击内元的 5’拼接点拼接点 G- 内元、左外元（有游离内元、左外元（有游离3’OH））  第二步：第二步： 游离外元（左）发动的转酯反应游离外元（左）发动的转酯反应 左外元的左外元的3’-OH 攻击攻击3’拼接点，同时释放拼接点，同时释放 线状的内元线状的内元,形成形成成熟成熟RNA分子分子 ☻ 两次转酯反应是紧密偶联的两次转酯反应是紧密偶联的 ☻ 释放出的内元可继续进行转酯反应释放出的内元可继续进行转酯反应 而形成环状而形成环状 （（5）） 自我拼接过程主要由转酯反应构成，且完全由内元自身自我拼接过程主要由转酯反应构成，且完全由内元自身 完成完成--------自我拼接的最大特点自我拼接的最大特点 • 转酯反应是转酯反应是………. • 内元自身能形成特定的二级结构，产生适于拼接反内元自身能形成特定的二级结构，产生适于拼接反 应的构象和活性位点应的构象和活性位点,在在G的参与下完成拼接反应的参与下完成拼接反应 (内部引导序列内部引导序列) 这一机制如下图所示这一机制如下图所示 :科罗拉多大学科罗拉多大学Cech等人完成（美）等人完成（美）活性位点活性位点上节课内容回顾上节课内容回顾:1、、pol(A)的生物学功能的生物学功能 2、、Euk.转录产物内元的去除转录产物内元的去除tRNA内元的拼接内元的拼接内元的分类内元的分类拼接方式的种类拼接方式的种类第类内元的拼接：第类内元的拼接： 结构特点结构特点 、拼接机制、拼接机制3、内元的催化功能、内元的催化功能 35SRNA前体拼接释放的内元（前体拼接释放的内元（414base）进行的自身转）进行的自身转 酯反应酯反应 （（1）线状分子自身环化能力及环化后的逆环化）线状分子自身环化能力及环化后的逆环化A 16（线性片段）（线性片段）U20(线性片段线性片段)逆逆环环化化逆逆环环化化 （（2）） C—15: 逆环化逆环化 将将UUU加到加到 5’端的能力端的能力 表明表明: 该环形产物具有连接两个该环形产物具有连接两个RNA分子的能力分子的能力 （（3）） L—19：： 具有酶活性具有酶活性 即即Cech等人证明的等人证明的 L—19 的的 polyC 聚合酶活性聚合酶活性L—19 分子分子 L—19 分子分子 （（4））总结：总结： a、、 四膜虫的四膜虫的 35SRNA 的内元有自身催化的性质的内元有自身催化的性质 即即 --- 将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷将一处已有的磷酸二酯键转变成另一处新的磷 酸二酯键，不需要额外的能量酸二酯键，不需要额外的能量 因此：因此： 内元可以看作是内元可以看作是 RNA重排酶（重排酶（RNA rearrangease）） 或或 RNA异构酶（异构酶（RNA isomerase）） 其中：其中： 拼接反应中，拼接反应中，“酶酶” 和底物是同一个分子，且反应后和底物是同一个分子，且反应后 变成了不同的分子变成了不同的分子 b、、L—19的的 polyC 聚合酶活性进一步表明聚合酶活性进一步表明 L—19 具有酶的具有酶的 主要特征：主要特征： 专一性强专一性强 加快反应速度加快反应速度 反应前后酶分子保持不变反应前后酶分子保持不变 人们称这种由人们称这种由RNA构成的酶为构成的酶为---- 核糖核酸酯酶（核糖核酸酯酶（ribozyme）） 可简称可简称 R酶酶四、第二类内元的拼接四、第二类内元的拼接 1、拼接点序列、拼接点序列 7核苷酸的保守序列核苷酸的保守序列 （（Branch Site ）） 3’ 拼接点上游拼接点上游 6bp ~ 12bp 处处 ● 5’----exon----- GUGCG---------B.S----Py AU ----exon---3’ 供点供点受点受点----Py Pu Py Py U A Py--- 100% ● 在在Branch Site 的两侧存在一些短的序列，的两侧存在一些短的序列， 与其上游与其上游10-50Nt处互成处互成 IR,形成茎环结构形成茎环结构(但但A 不包含在不包含在 IR序列内序列内, 从而被排除成芽状突起）从而被排除成芽状突起） 5’--GUGCG--------------------PyPuPyPyUAPy-----PyAU—3’Intron IR IR 5’ G AU 3’ A2、拼接机制（、拼接机制（Splicing mechanism）） Int ron IR IR A5’ G AU 3’ Exon 1 Exon2 G A intron PyAU Matural RNA “LariatLariat” intronintron 套索状内元转酯攻击位点转酯攻击位点intron OH AU 2‘ A 3‘G五、核基因五、核基因mRNA内元的拼接内元的拼接 1、相关概念、相关概念 Euk.的细胞中，有许多碱基数在的细胞中，有许多碱基数在100 ~ 300之间之间 的的小分子小分子RNA,每个细胞有每个细胞有 105~106个个 snRNAsnRNA：：：： 细胞核中的细胞核中的细胞核中的细胞核中的 （（（（snRNPsnRNP）））） scRNAscRNA：：：： 细胞质中的细胞质中的细胞质中的细胞质中的 （（（（scRNPscRNP）））） 2 2、核、核、核、核mRNAmRNA内元拼接的结构特点内元拼接的结构特点内元拼接的结构特点内元拼接的结构特点 内元拼接与其他加工同时进行内元拼接与其他加工同时进行拼接点序列拼接点序列 Breathnach-Chambon rule （（GU－－AG规则）规则）● 5’---exon--- GU--------intron--------AG ------exon----3’供点供点 100% 94% 受点受点● 7Nt branch site 3’拼接点的上游拼接点的上游 py X py U pu A py 3、拼接机制（、拼接机制（Splicing Splicing mehanismmehanism ) ● SnRNA (or ScRNA) 与拼接点序列间存在互补区域与拼接点序列间存在互补区域 并参与剪接并参与剪接, , 形成拼接体形成拼接体( spliceosomespliceosome) )。

● Spliceosome 逐级组装，逐级组装， SnRNA（（U1、、U2、、U5和和 U4／／U6））分步替代分步替代● U1通过与通过与 5 5’拼接点互补而结合拼接点互补而结合 U2识别并结合分支识别并结合分支 点点A U1和和U2作用使内元的作用使内元的 5’端和端和 3’端带到端带到 一起（一起（U1与与 3’拼接点配对）拼接点配对） U1、、U2、、mRNA与与 U4－－U5－－U6复合物形成一个完整的拼接体复合物形成一个完整的拼接体● 第一次转酯－－左外元、内元剪切套索第一次转酯－－左外元、内元剪切套索lariat● 第二次转酯－－第二次转酯－－exons连接、套索状内元释放连接、套索状内元释放● 拼接体（拼接体（spliceosome）） 解体与解体与lariat降解同步降解同步第九节第九节 不连续转录和反式拼接不连续转录和反式拼接Discontinuous—transcription and Trans-splicing 顺式拼接：顺式拼接： 通过拼接将一个通过拼接将一个RNA分子的内元拼接掉，使外元分子的内元拼接掉，使外元 连接在一起（连接在一起（cis-splicing）） 反式拼接：反式拼接： 发生在两个发生在两个RNA分子之间的拼接（分子之间的拼接（trans-spling）） 一、不连续转录的发现一、不连续转录的发现 1982 Vander Ploeg等人等人 研究锥虫的可变表面糖蛋白基因时研究锥虫的可变表面糖蛋白基因时发现发现 在其在其mRNA的的 5’端有端有35个个 bases 是其基因中所没有的是其基因中所没有的 锥虫的全部锥虫的全部mRNA都含有这个都含有这个 35bases 序列序列 称其为前导序列（称其为前导序列（leader sequence）） 1、、 前导序列前导序列 • 由位于基因组其它区域的连续重复序列转录而来由位于基因组其它区域的连续重复序列转录而来 • 200 copies左右左右 • 每个重复单位的每个重复单位的 3’端还有端还有100base 的一段序列的一段序列（内元）（内元） 因此因此 一种完整一种完整 mRNA 的的前导序列前导序列及及特异基因编码的特异基因编码的 mRNA序列序列 部分部分的转录是的转录是不连续的不连续的 ♫ 每个重复单位的前导序列后面存在一个真核生物典型的每个重复单位的前导序列后面存在一个真核生物典型的 5’拼接点拼接点 GU ♫ 而完整而完整 mRNA 的特异基因编码的的特异基因编码的 mRNA 序列的前面都序列的前面都 有一个保守的有一个保守的 3’拼接点拼接点 AG,以及分支点以及分支点 A A二、反式拼接二、反式拼接 前导序列与特异基因编码的前导序列与特异基因编码的 mRNA 序列部分形成成熟的序列部分形成成熟的 mRNA 的拼接方式属反式拼接的拼接方式属反式拼接 1986 W. J. Marphy 和和 R. E. Sutton 1、、 前导序列的前导序列的 3’ 区和区和mRNA的的 5’区各相当于一个内元区各相当于一个内元 的一半的一半 2、、 拼接过程形成拼接过程形成 Y 型结构型结构 线虫的肌动蛋白基因、植物叶绿体基因线虫的肌动蛋白基因、植物叶绿体基因本章本章内容结束内容结束名词解释转录 启动子 RNA拼接 左、右拼接点 不连续转录反式拼接 转录终止子 简答题1、说明RNApol全酶各个亚基的主要功能。

2、以E.coli为例，说出Prok.启动子结构及各部分功能3、以Prok.为例简述转录起始过程4、终止子和终止密码子有何区别？5、试述Prok.中转录终止子的类型及终止机制6、解释E.coli的λ噬菌体调控不同发育阶段基因表达的抗终止机 制7、、 简述内元的种类及拼接方式简述内元的种类及拼接方式8、、 说明说明tRNA内元拼接的简单步骤和特点内元拼接的简单步骤和特点9、、 tRNA基因的类型及各类型的前体在加工过程中所要解决的基因的类型及各类型的前体在加工过程中所要解决的 问题10、说明、说明poly(A)在分子生物学实验中的应用价值在分子生物学实验中的应用价值11、为什么在细菌（、为什么在细菌（Prok.）中很少涉及到）中很少涉及到ρ因子？因子？12、、Euk.mRNA帽子的种类帽子的种类13、以四膜虫的大、以四膜虫的大rRNA前体的拼接为例，说明第前体的拼接为例，说明第ⅠⅠ类内元拼接类内元拼接 的简单过程及特点的简单过程及特点15、综合比较四种内元拼接方式的异同综合比较四种内元拼接方式的异同16、解释、解释“套索结构套索结构”，及内元中的套索结构中的磷酸二酯键有，及内元中的套索结构中的磷酸二酯键有何何 特殊之处。

特殊之处14、真核生物、真核生物mRNA的的3‘poly(A)的编码情况及其准确生成的机制的编码情况及其准确生成的机制 为何？为何？。