组织培养第三章-愈伤组织培养资料课件.ppt

第三章第三章 愈伤组织培养愈伤组织培养宜职院宜职院08.9 目的与要求目的与要求 了解胚状体概念，学习愈伤组织的离体培养方了解胚状体概念，学习愈伤组织的离体培养方式，掌握愈伤组织继代培养的培养基和培养条件，式，掌握愈伤组织继代培养的培养基和培养条件，了解继代培养物的分化，掌握愈伤组织培养的应了解继代培养物的分化，掌握愈伤组织培养的应用 具有胚状体概念、懂得愈伤组织诱导分化的阶具有胚状体概念、懂得愈伤组织诱导分化的阶段特点具有愈伤组织的形态发生规律知能具有愈伤组织的形态发生规律知能第一节第一节 愈伤组织的培养愈伤组织的培养 愈伤组织培养是指将母体植株上的各个愈伤组织培养是指将母体植株上的各个部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养部分切下，形成外植体，接种到无菌的培养基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一基上，进行愈伤组织诱导、生长和发育的一门技术 一般情况下，植物组织均能诱发形成愈一般情况下，植物组织均能诱发形成愈伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植伤组织，由外植体形成愈伤组织，标志着植物离体培养的开始物离体培养的开始 一、愈伤组织的诱导一、愈伤组织的诱导（一）诱导原理（一）诱导原理1 1、细胞全能性、细胞全能性 植物每一细胞具有全套遗传信息，在特植物每一细胞具有全套遗传信息，在特定环境下能进行表达，而产生一个独立完定环境下能进行表达，而产生一个独立完整的个体。

整的个体  只要有一个完整的膜系统和一个只要有一个完整的膜系统和一个有生命力的核，即使已经是高度分化有生命力的核，即使已经是高度分化的植物细胞，也还保持恢复到分生状的植物细胞，也还保持恢复到分生状态的能力其恢复能力取决于该细胞态的能力其恢复能力取决于该细胞原来所处的部位和生理状态原来所处的部位和生理状态2 2、脱分化现象、脱分化现象 一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分一个已经停止分裂的成熟细胞转变为分生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象生状态，并形成未分化的愈伤组织的现象 植物离体培养中的脱分化过程植物离体培养中的脱分化过程: :植物离体植物离体培养利用特定的条件，促进细胞脱分化，使培养利用特定的条件，促进细胞脱分化，使原已分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道，原已分化并具有一定功能的细胞脱离原轨道，失去其原有状态和功能，而恢复到未分化的失去其原有状态和功能，而恢复到未分化的愈伤组织状态愈伤组织状态 3 3、诱导程度、诱导程度双子叶植物比单子叶植物容易双子叶植物比单子叶植物容易幼年细胞组织比成年细胞组织容易幼年细胞组织比成年细胞组织容易二倍体细胞比单倍体细胞容易二倍体细胞比单倍体细胞容易 （二）诱导方法（二）诱导方法1 1、根据不同的培养目的，获取不同的外植、根据不同的培养目的，获取不同的外植体。

体 植株茎的切段、叶、根、花和种子，或某植株茎的切段、叶、根、花和种子，或某些组织切成片或块状，均可接种到培养基上些组织切成片或块状，均可接种到培养基上 接种时需考虑材料的一致性，来源、产地、接种时需考虑材料的一致性，来源、产地、大小、形状、生理部位常选组织块较大的材大小、形状、生理部位常选组织块较大的材料  获取外植体材料－消毒处理－修整除去获取外植体材料－消毒处理－修整除去坏死组织－切成坏死组织－切成5mm5mm的圆柱形或方形小块－的圆柱形或方形小块－直放或倒放到培养基上－每直放或倒放到培养基上－每9cm9cm培养基接种培养基接种5 5－－6 6块外植体－培养块外植体－培养2、操作程序、操作程序 选用较大组织做材料时，可用打孔器选用较大组织做材料时，可用打孔器从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切从块茎和块根中钻取一批圆柱型组织，切成相同厚度的小圆片进行培养成相同厚度的小圆片进行培养 采用圆形的原因：采用圆形的原因： 能得到外形简单结构相同的材料能得到外形简单结构相同的材料 圆形的表面积大圆形的表面积大 圆柱形的外植体有利于组织块与外界进圆柱形的外植体有利于组织块与外界进行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈行物质和气体交换；也使外植体表面促进愈伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高。

伤组织形成的分泌物较多，诱导率增高培养基培养基 MS培养基培养基 激素激素 IAA、、NAA、、2,4-D、、BA 椰子汁、番茄汁、酵母提取物椰子汁、番茄汁、酵母提取物 二、愈伤组织细胞的分化二、愈伤组织细胞的分化 单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤单个细胞或一块外植体形成典型的愈伤组织，大致经历三个时期，这三个时期中细组织，大致经历三个时期，这三个时期中细胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别胞代谢、细胞数目、细胞形态均有明显差别 （一）诱导期（一）诱导期 诱导期是细胞正在准备分裂的时期诱导期是细胞正在准备分裂的时期1 1、诱导期、诱导期特征特征 细胞质增加，出现活跃的原生质流动，细胞质增加，出现活跃的原生质流动，贮藏物质淀粉等消失；随着组织的活化，细胞贮藏物质淀粉等消失；随着组织的活化，细胞内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；内核糖体增加并形成大量多聚核糖体；RNARNA迅迅速合成和累积；但细胞大小无多大变化速合成和累积；但细胞大小无多大变化 诱导期诱导期2 2、影响愈伤组织诱导的因素、影响愈伤组织诱导的因素 植物种类、生理状况、外部因素不同，植物种类、生理状况、外部因素不同，诱导期不同。

诱导期不同 弱光弱光下植株比强光下的植株外植体易于下植株比强光下的植株外植体易于诱导分裂诱导分裂 二氧化碳抑制诱导分化二氧化碳抑制诱导分化 生长调节剂诱导细胞开始分裂生长调节剂诱导细胞开始分裂 损伤剌激损伤剌激能加速脱分化进行，有时还能加速脱分化进行，有时还是是某些材料能否脱分化的决定条件某些材料能否脱分化的决定条件 离体培养后细胞变化：离体培养后细胞变化： 气体交换迅速增加；气体交换迅速增加； RNA RNA出现；出现； 蛋白质发生周期性变化；蛋白质发生周期性变化； 酶水平变化酶水平变化 （二）分裂期（二）分裂期 分裂期是指细胞脱分化，细胞通过分裂期是指细胞脱分化，细胞通过分裂不断增生子细胞而形成愈伤组织的分裂不断增生子细胞而形成愈伤组织的过程植物分裂期脱分化规律：植物分裂期脱分化规律： 胡萝卜等脱分化较禾谷类容易胡萝卜等脱分化较禾谷类容易 茎叶较花器脱分化茎叶较花器脱分化 幼嫩茎组织比老组织较容易幼嫩茎组织比老组织较容易分裂期分裂期2 2、分裂期愈伤组织、分裂期愈伤组织特征特征：： 细胞数目增加、体积变小、核和核细胞数目增加、体积变小、核和核仁变大、仁变大、RNARNA含量持续上升。

从培养外植含量持续上升从培养外植体的形态变化来看，表现为外层细胞迅速体的形态变化来看，表现为外层细胞迅速分裂当细胞体积最小，细胞核和核仁最分裂当细胞体积最小，细胞核和核仁最大，大，RNARNA含量最高时，标志着细胞处于分含量最高时，标志着细胞处于分裂高峰时期裂高峰时期魔芋愈伤组织（分裂期）魔芋愈伤组织（分裂期）分化期主要分化期主要变化变化为为 1 1、细胞分裂部位和方向发生改变、细胞分裂部位和方向发生改变 2 2、分生组织瘤状结构和维管组织形成、分生组织瘤状结构和维管组织形成 3 3、细胞体积不再减小、细胞体积不再减小 4 4、出现各种类型细胞、出现各种类型细胞 5 5、颜色变化、颜色变化愈伤组织分化期愈伤组织分化期第二节第二节 愈伤组织的继代培养愈伤组织的继代培养一、培养基和培养条件一、培养基和培养条件（一）培养基（一）培养基 常用于愈伤组织继代培养的培养基有常用于愈伤组织继代培养的培养基有MSMS、、N6N6 细胞分裂素细胞分裂素/ /生长素比例控制器官发生的模式：生长素比例控制器官发生的模式：IAA/KTIAA/KT高，利于根形成高，利于根形成IAA/KTIAA/KT低，利于芽的分化低，利于芽的分化IAA/KTIAA/KT适中，则产生愈伤组织适中，则产生愈伤组织 GA3GA3乙烯利乙烯利PP333PP333天然提取物：天然提取物： 椰乳，浓度椰乳，浓度10%10% 番茄汁，浓度番茄汁，浓度5-10%5-10% 香蕉汁香蕉汁5 5，浓度，浓度-10%-10%注意：注意： - -植物离体培养中，及时更换植植物离体培养中，及时更换植物生长物质的种类和浓度，才能有效物生长物质的种类和浓度，才能有效控制器官的分化。

控制器官的分化 - -生长物质用量影响器官分化生长物质用量影响器官分化IAAIAA、、IBAIBA处理根比较壮，处理根比较壮，2,4-D2,4-D对生根对生根不利BABA比比KTKT诱导芽效果强，诱导芽效果强，ZTZT作用作用窄3 3、有机成分、有机成分 酪氨酸明显增强烟草组织的器官形成酪氨酸明显增强烟草组织的器官形成 酰胺类促进器官形成酰胺类促进器官形成 水解酪蛋白、水解乳蛋白为多种氨基酸混合物水解酪蛋白、水解乳蛋白为多种氨基酸混合物 腺嘌呤促进茎切段培养中芽的形成腺嘌呤促进茎切段培养中芽的形成 糖提供外植体能量，维持一定水势糖提供外植体能量，维持一定水势 4 4、物理性质、物理性质⑴⑴培养基形式、水势，对形态发生有明显影响培养基形式、水势，对形态发生有明显影响 诱导愈伤组织诱导愈伤组织- -固态培养基固态培养基 细胞和体细胞胚增值细胞和体细胞胚增值- -液态培养基液态培养基 胚状体发育成苗胚状体发育成苗- -固态培养基固态培养基⑵⑵培养基培养基PHPH值对芽分化有影响值对芽分化有影响 （二）培养条件（二）培养条件1 1、光照、光照 愈伤组织培养中，某些植物诱导要求在愈伤组织培养中，某些植物诱导要求在黑暗中生长，大多数都需要光。

黑暗中生长，大多数都需要光 有的葡萄品种对短日照敏感，烟草愈伤有的葡萄品种对短日照敏感，烟草愈伤组织需要蓝光组织需要蓝光2 2、温度、温度 一般一般24—28℃24—28℃，有些植物需要一定昼，有些植物需要一定昼夜温差 1 1、生理因素、生理因素 多次继代后不加多次继代后不加IAAIAA也可达到同样生长量也可达到同样生长量 不同培养物保持分化潜力不同不同培养物保持分化潜力不同 丧失分化能力的组织，加入腺嘌呤、酪蛋白、丧失分化能力的组织，加入腺嘌呤、酪蛋白、酵母汁后，可恢复一定分化能力酵母汁后，可恢复一定分化能力2 2、遗传因素、遗传因素 继代培养中易出现染色体紊乱，分化能力丧继代培养中易出现染色体紊乱，分化能力丧失与倍性不稳定有关失与倍性不稳定有关二、继代培养物的分化潜力二、继代培养物的分化潜力三、继代培养物的体细胞变异三、继代培养物的体细胞变异后生遗传变异：后生遗传变异： 即离体培养组织在培养中获得激素的自主即离体培养组织在培养中获得激素的自主性（有外源激素才能生长的组织，后期自身产性（有外源激素才能生长的组织，后期自身产生激素）。

生激素） 影响后生遗传变异产生的因素主要有：影响后生遗传变异产生的因素主要有：1 1、组织自然倾向、组织自然倾向2 2、培养基化学成分和物理状态、培养基化学成分和物理状态 第三节第三节 愈伤组织的形态发生愈伤组织的形态发生 概念：概念：极性极性——植物细胞分化中的一个基本现象，植物细胞分化中的一个基本现象，指植物的器官、组织、甚至单个细胞在指植物的器官、组织、甚至单个细胞在不同轴向上存在的某种形态结构以及生不同轴向上存在的某种形态结构以及生理生化上的梯度差异理生化上的梯度差异细胞无性系细胞无性系——植物离体培养中，任何形植物离体培养中，任何形式的细胞培养所产生的植株，即称细胞式的细胞培养所产生的植株，即称细胞无性系 植物愈伤组织离体培养中，脱分化形植物愈伤组织离体培养中，脱分化形成无极性或无明显形态的愈伤组织块成无极性或无明显形态的愈伤组织块当条件适合时，愈伤组织发生再分化而当条件适合时，愈伤组织发生再分化而产生芽或根的分生组织，甚至体细胞胚，产生芽或根的分生组织，甚至体细胞胚，进而发育成苗或完整植株进而发育成苗或完整植株 愈伤组织的形态发生有以下两种情况：愈伤组织的形态发生有以下两种情况：一、不定芽和根的发生（器官发生）一、不定芽和根的发生（器官发生） 是愈伤组织培养物或细胞培养中常见是愈伤组织培养物或细胞培养中常见的器官发生方式。

的器官发生方式 （一）愈伤组织通过不定芽和根形成（一）愈伤组织通过不定芽和根形成器官的阶段器官的阶段1 1、外植体脱分化、外植体脱分化- -愈伤组织愈伤组织 2 2、愈伤组织、愈伤组织- -瘤状结构瘤状结构3 3、瘤状结构、瘤状结构- -器官原基器官原基 叶片愈伤组织的形成叶片愈伤组织的形成（二）愈伤组织的器官发生顺序（二）愈伤组织的器官发生顺序1 1、无芽的根或无根的芽、无芽的根或无根的芽 愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成，愈伤组织仅有芽或根器官的分别形成，不能形成完整植株不能形成完整植株 2 2、先芽后根、先芽后根 愈伤组织先形成芽，芽生长后，其基愈伤组织先形成芽，芽生长后，其基部发出根，进而形成小植株，是大多数植部发出根，进而形成小植株，是大多数植物的器官发生方式物的器官发生方式 如苹果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、如苹果、葡萄、柑橘、番茄、菊花、小麦、水稻小麦、水稻3 3、先根后芽、先根后芽 先形成根，再从根的基部分化出芽先形成根，再从根的基部分化出芽形成小植株，双子叶植物中普遍形成小植株，双子叶植物中普遍 如颠茄、枸杞、苜蓿如颠茄、枸杞、苜蓿4 4、分别形成芽和根、分别形成芽和根 愈伤组织邻近不同部位分别形成芽愈伤组织邻近不同部位分别形成芽和根，两者结合起来形成一株小植株，类和根，两者结合起来形成一株小植株，类似根芽的天然嫁接。

似根芽的天然嫁接 如胡萝卜、石刁柏如胡萝卜、石刁柏二、体细胞胚的发生二、体细胞胚的发生（一）胚状体的概念（一）胚状体的概念 胚状体胚状体- -离体培养下没有经过受精过离体培养下没有经过受精过程，但经历了胚胎发育过程所形成的胚的程，但经历了胚胎发育过程所形成的胚的类似物，统称为体细胞胚或胚状体类似物，统称为体细胞胚或胚状体 胚状体可以从花药或花粉培养、愈伤胚状体可以从花药或花粉培养、愈伤组织培养、离体器官培养、单细胞悬浮培组织培养、离体器官培养、单细胞悬浮培养中产生养中产生二）胚状体的发育过程（二）胚状体的发育过程 细胞分化细胞分化————持续细胞分裂增殖持续细胞分裂增殖————原胚期原胚期————球形胚球形胚————心形胚心形胚————鱼雷形胚鱼雷形胚————子叶期子叶期（三）胚状体的类别（三）胚状体的类别1 1、体细胞胚、体细胞胚 来源于根、茎、叶和它们的组织和细胞，来源于根、茎、叶和它们的组织和细胞，经离体培养而发生的类胚结构，染色体组为经离体培养而发生的类胚结构，染色体组为两套，可发育成为正常植物体两套，可发育成为正常植物体2 2、生殖细胞胚、生殖细胞胚 来源于大小孢子细胞，经离体培养而形来源于大小孢子细胞，经离体培养而形成的类胚结构，染色体为单套，可发育成单成的类胚结构，染色体为单套，可发育成单倍体植物体，经染色体加倍成为可育植物。

倍体植物体，经染色体加倍成为可育植物3 3、三倍体胚、三倍体胚 来源于胚乳细胞的胚状体，具三套染色来源于胚乳细胞的胚状体，具三套染色体组三倍体植物具不育性三倍体植物具不育性魔芋体细胞胚魔芋体细胞胚（四）胚状体形成植株的特征（四）胚状体形成植株的特征1 1、具有两极性、具有两极性 细胞发育早期阶段，从其相反的两端分细胞发育早期阶段，从其相反的两端分化出芽端与根端，而不定芽和不定根都是单化出芽端与根端，而不定芽和不定根都是单向极性2 2、胚状体的维管组织与外植体的维管组织、胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽和不定根往无解剖结构上的联系，而不定芽和不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系往总是与愈伤组织的维管组织相联系3 3、胚状体的维管组织的分布是独立的、胚状体的维管组织的分布是独立的““ＹＹ””形，而不定芽和不定根的维管组织无此现形，而不定芽和不定根的维管组织无此现象 （五）胚状体发生影响因素：（五）胚状体发生影响因素： 铵态氮对胚状体的发生有利，也可同铵态氮对胚状体的发生有利，也可同时使用铵态氮和硝态氮时使用铵态氮和硝态氮 赤霉素、细胞分裂素抑制胚状体发生赤霉素、细胞分裂素抑制胚状体发生 生长素类对胚状体的发生有重要作用生长素类对胚状体的发生有重要作用 （六）胚状体形成植株的优点（六）胚状体形成植株的优点 1 1、胚状体的数量比不定芽多、胚状体的数量比不定芽多2 2、胚状体可制成人工种子，便于运输、胚状体可制成人工种子，便于运输和贮藏和贮藏3 3、胚状体的有性后代遗传性更接近母、胚状体的有性后代遗传性更接近母体植株。

体植株 第四节第四节 愈伤组织培养的应用愈伤组织培养的应用 外植体不经愈伤组织发育成器官两种情况：外植体不经愈伤组织发育成器官两种情况： 1 1、外植体中已存在器官原基，进一步形成、外植体中已存在器官原基，进一步形成相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根相应的组织器官进而再生植株，如茎尖、根尖分生组织培养尖分生组织培养 2 2、外植体某些部位的细胞，在重新分裂后，、外植体某些部位的细胞，在重新分裂后，直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形直接形成分生细胞团，然后由分生细胞团形成器官原基成器官原基 除茎尖分生组织培养和部分器官培养外，除茎尖分生组织培养和部分器官培养外，所有培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生所有培养形式最终都要经历愈伤组织才能产生再生植株，愈伤组织也常是悬浮培养的细胞和再生植株，愈伤组织也常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源原生质体的来源（一）愈伤组织培养多种用途：（一）愈伤组织培养多种用途： 1 1、研究植物生长发育与分化的机制、、研究植物生长发育与分化的机制、遗传变异规律，对植物遗传育种有特殊意遗传变异规律，对植物遗传育种有特殊意义义 2 2、大规模工厂化生产有用化合物，或、大规模工厂化生产有用化合物，或用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产用于细胞培养筛选工业、农业、医药生产上有用的无性系，或用于原生质体来源。

上有用的无性系，或用于原生质体来源 实践证明，愈伤组织不仅是一种植物实践证明，愈伤组织不仅是一种植物快繁的新手段，同时也是品种改良，种质快繁的新手段，同时也是品种改良，种质资源保存和有用化合物生产的理想途径资源保存和有用化合物生产的理想途径 （二）在园艺植物育种中的应用：（二）在园艺植物育种中的应用： 1 1、加快园艺植物新品种和良种繁育速度，、加快园艺植物新品种和良种繁育速度，迅速高效低成本迅速高效低成本 2 2、培养无病毒苗木、培养无病毒苗木 3 3、获得倍性不同植株，易染色体核内加、获得倍性不同植株，易染色体核内加倍育种有利用价值倍育种有利用价值 4 4、克服远缘杂交困难、克服远缘杂交困难 5 5、利于种质资源长期保存、利于种质资源长期保存 6 6、提供育种中间材料、提供育种中间材料 7 7、诱发和离体筛选突变体、诱发和离体筛选突变体 8 8、制造人工种子、制造人工种子 植物离体培养中的器官发生类型：植物离体培养中的器官发生类型： 不定芽型不定芽型——诱导顶端分生组织产生不定诱导顶端分生组织产生不定芽，再生成植株的方式顶芽、腋芽培养芽，再生成植株的方式。

顶芽、腋芽培养多数植物培养采用多数植物培养采用 特点：繁殖率高、遗传稳定性好特点：繁殖率高、遗传稳定性好 器官型器官型——从器官外植体诱导不定芽，再从器官外植体诱导不定芽，再生成植株的方式茎、叶、花器、鳞片培养生成植株的方式茎、叶、花器、鳞片培养 特点：繁殖速度慢，遗传性状较稳特点：繁殖速度慢，遗传性状较稳器官发生型器官发生型——从器官外植体诱导愈伤组织，从器官外植体诱导愈伤组织，经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式经愈伤组织细胞的分化再生成植株的方式 特点：繁殖速度快、遗传性状不稳定特点：繁殖速度快、遗传性状不稳定类胚体发生类胚体发生——由植物体器官、组织和细胞培由植物体器官、组织和细胞培养而直接发生类胚结构，最后以胚状体成苗养而直接发生类胚结构，最后以胚状体成苗的方式 特点：遗传性一致，体细胞发生数量大特点：遗传性一致，体细胞发生数量大原球茎型原球茎型——兰属特有的器官发生方式，种子兰属特有的器官发生方式，种子培养发生原球茎，原球茎直接长成植株培养发生原球茎，原球茎直接长成植株 特点：遗传较稳、繁殖率不高特点：遗传较稳、繁殖率不高思考：1 1、叙述愈伤组织培养的诱导方法。

叙述愈伤组织培养的诱导方法2 2、继代培养物的分化潜力的影响因素如何继代培养物的分化潜力的影响因素如何3 3、愈伤组织器官发生顺序的情况有哪些？、愈伤组织器官发生顺序的情况有哪些？4 4、说明愈伤组织培养的多种用途说明愈伤组织培养的多种用途课后查阅：课后查阅：1、植物愈伤组织形成中激素的作用有、植物愈伤组织形成中激素的作用有什么规律？什么规律？2、环境条件对植物细胞的脱分化和再、环境条件对植物细胞的脱分化和再分化有什么影响？分化有什么影响？。