实验三双缩脲法蛋白质含量测定.ppt

蛋白质含量测定蛋白质含量测定 实验目的1学习分光光度法测定的原理和方法学习分光光度法测定的原理和方法2学习蛋白质含量测定的原理和方法学习蛋白质含量测定的原理和方法3掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法实验原理实验原理 双缩脲（双缩脲（NH3CONHCONH3））是两个分子脲经是两个分子脲经180℃℃左右加热，左右加热，放出一个分子氨后得到的产物放出一个分子氨后得到的产物在强碱性溶液中，双缩脲与在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双形成紫色络合物，称为双缩脲反应凡具有两个酰胺基或缩脲反应凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应化合物都有双缩脲反应 紫色络合物紫色络合物 紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量测质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量测定范围为定范围为1-10mg蛋白质干扰这一测定的物质主要有：蛋白质。

干扰这一测定的物质主要有：Tris缓冲液和某些氨基酸等缓冲液和某些氨基酸等 此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少主要的缺点是灵敏度差因此双缩脲近，以及干扰物质少主要的缺点是灵敏度差因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定 蛋白质测定方法:1双缩脲法（biuret法） 2微量凯氏（kjeldahl）定氮法 3folin—酚试剂法4考马斯亮兰法5紫外吸收法 6总蛋白定量分析－BCA实验试剂与器材实验试剂与器材 （一）、实验试剂（一）、实验试剂 1、标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（、标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或）或标准酪蛋白，配制成标准酪蛋白，配制成10mg/ml的标准蛋白溶液，牛血清清蛋的标准蛋白溶液，牛血清清蛋白用白用H2O 或或0.9%NaCl配制，酪蛋白用配制，酪蛋白用0．．05N NaOH配制 2、双缩脲试剂、双缩脲试剂 （二）、实验器材（二）、实验器材 可见光分光光度计可见光分光光度计  分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射下，产生了对分光光度计的基本原理是溶液中的物质在光的照射下，产生了对光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的。

各种不同的物质都光吸收的效应，物质对光的吸收是具有选择性的各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被具有其各自的吸收光谱，因此当某单色光通过溶液时，其能量就会被吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也吸收而减弱，光能量减弱的程度和物质的浓度有一定的比例关系，也即符合比色原理即符合比色原理——Lambert-Beer's law: 数学表达式数学表达式: A=lg(1/T)=KCL A为吸光度为吸光度 T为透射率为透射率,是投射光强度比上入射光强度是投射光强度比上入射光强度 C为吸光物质的浓度为吸光物质的浓度 L为吸收层厚度为吸收层厚度 K为吸收系数为吸收系数 物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时物理意义是当一束平行单色光垂直通过某一均匀非散射的西光物质时,其吸光度其吸光度A与吸光物质的浓度与吸光物质的浓度C及吸收层厚度及吸收层厚度L成正比成正比. 仪器操作键介绍仪器操作键介绍“方式设定方式设定”键（键（MODE）：用于设置测试方）：用于设置测试方式式“100%T/0ABS”键：用于自动调整键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比透射比)或或0ABS(零吸光度零吸光度)“0%T”键：用于自动调整零透射比键：用于自动调整零透射比“波长设置波长设置”旋钮：用于设置分析波长旋钮：用于设置分析波长样品测试操作样品测试操作①① 打开电源开关，使仪器预热打开电源开关，使仪器预热20分钟分钟②② 用用“波长设置波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上③③ 打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路打开样品室盖，将挡光体插入比色皿架，并将其推或拉入光路④④ 盖好样品室盖，按盖好样品室盖，按“0%T”键调透射比零键调透射比零⑤⑤ 取出挡光体，盖好样品室盖，按取出挡光体，盖好样品室盖，按“100%T”调调100%透射比透射比⑥⑥ 按按“方式键方式键”（（MODE）将测试方式设置为吸光度方式）将测试方式设置为吸光度方式(A)⑦⑦ 将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中⑧⑧ 打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖室盖⑨⑨ 将参比溶液推入或拉入光路中，按将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%T”调零调零A⑩⑩ 将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数参数实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。

实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布 使用注意使用注意:1每次测量前检查每次测量前检查,检查波长是否所需值检查波长是否所需值;2比色皿应拿磨砂面比色皿应拿磨砂面,不可用手接触透光面不可用手接触透光面;3比色皿在盛装样品前比色皿在盛装样品前,应用所盛样品冲洗两次应用所盛样品冲洗两次,装样量为装样量为比色皿的比色皿的2/3容积容积;4向比色皿加样时向比色皿加样时,若样品流到比色皿外壁时若样品流到比色皿外壁时,应用滤纸点应用滤纸点干干,切忌用滤纸擦拭切忌用滤纸擦拭,比色皿易出现划痕比色皿易出现划痕;5测量结束后应用蒸馏水清洗比色皿测量结束后应用蒸馏水清洗比色皿,清洗干净后放起清洗干净后放起.操作方法操作方法 1、标准曲线的测定、标准曲线的测定 取取12支试管分两组，分别加入支试管分两组，分别加入0，，0.2，，0.4，，0.6，，0.8，，1.0毫升毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂毫升双缩脲试剂充分摇匀后，在室温（充分摇匀后，在室温（20~25℃℃）下放置）下放置20分钟，于分钟，于540nm处进行处进行比色测定比色测定(30分钟内必须完成测定分钟内必须完成测定)。

用未加蛋白质溶液的第一支试用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座管作为空白对照液取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线2、样品的测定、样品的测定 取取2-3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度注意样品浓度不要超过注意样品浓度不要超过10mg/ml思考题1为什么双缩脲反应要求在30分钟内检测?2谈谈BCA法测定蛋白含量的优缺点,并与其他方法比较。