BD流式原理及应用.ppt

BD BiosciencesImmune FunctionTO HELP ALL PEOPLE LIVE HEALTHY LIVES成立于成立于18971897年年位居财富周刊位居财富周刊500500强的大型跨国公司强的大型跨国公司产品涵盖诸多医疗领域产品涵盖诸多医疗领域BD BiosciencesBD Biosciences生物科学系统生物科学系统(全球最大的流式细胞全球最大的流式细胞仪生产商仪生产商/供应商供应商)注射器产品系列：疫苗注射器注射器产品系列：疫苗注射器临床标本采集系统临床标本采集系统感染性疾病诊断系统感染性疾病诊断系统在中国各大城市设有代表处在中国各大城市设有代表处第1页/共153页BD BiosciencesImmune Function市场情况市场情况1973年世界第一台商品化的流式细胞仪年世界第一台商品化的流式细胞仪FACS I由由BD公司和美公司和美国斯坦福大学共同研制成功国斯坦福大学共同研制成功1980年北京师范大学引进了中国的第一台流式细胞仪年北京师范大学引进了中国的第一台流式细胞仪FACS II BD是全球最大的流式细胞仪生产商和供应商，在全球的占有是全球最大的流式细胞仪生产商和供应商，在全球的占有率为率为75%，在中国，在中国75%在全国各大医院和科研院所，大部分为在全国各大医院和科研院所，大部分为BD公司的仪器，总计公司的仪器，总计数量已超过数量已超过700台，台，如如:清华，北大，中科院，军科院等等清华，北大，中科院，军科院等等第2页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionBD公司流式细胞仪公司流式细胞仪FACSCalibur L SRIIFACSCantoFACSCountFACSAria第3页/共153页流式细胞术概述流式细胞术概述第4页/共153页BD BiosciencesImmune Function流式细胞术的基本概念流式细胞术的基本概念=流式细胞术（流式细胞术（Flow Cytometry,Flow Cytometry,简称简称FCMFCM）是一种可以快速、是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单单个个微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，微粒（通常是细胞）的多项特性，并加以定量的技术，同时可以对特定群体加以分选同时可以对特定群体加以分选=研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等球等=研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量第5页/共153页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的检测范围流式细胞仪的检测范围细胞结构细胞结构=细胞大小=细胞颗粒度=细胞表面面积=核浆比例=DNA含量与细胞周期=RNA含量=蛋白质含量细胞功能细胞功能=细胞表面/胞浆/核的特异性抗原=细胞活性=细胞内细胞因子=酶活性=激素结合位点=细胞受体第6页/共153页流式细胞仪的原理流式细胞仪的原理第7页/共153页BD BiosciencesImmune Function第8页/共153页BD BiosciencesImmune Function散射光信号散射光信号FALS SensorLaser第9页/共153页BD BiosciencesImmune Function散射光信号散射光信号Right Angle Light Right Angle Light Detector Detector Cell Complexity Cell ComplexitySSCSSCForward Light Detector Forward Light Detector Cell Surface Area Cell Surface Area FSCFSCIncident Incident Light Light SourceSource=前向角散射光（前向角散射光（FSC,Forward ScatterFSC,Forward Scatter）细胞相对大小及其表面积细胞相对大小及其表面积 =侧向角散射光（侧向角散射光（SSC,Side ScatterSSC,Side Scatter）细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性细胞颗粒度及细胞内细胞器的相对复杂性第10页/共153页BD BiosciencesImmune Function外周全血细胞散射光双参数点图外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）（红细胞溶解后）GranulocytesMonocytesLymphocytes第11页/共153页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的检测信号流式细胞仪的检测信号荧光信号荧光信号使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量荧光信号的强弱，反映了细胞抗原的表达含量第12页/共153页BD BiosciencesImmune Function荧光信号荧光信号双色直接染色双色直接染色第13页/共153页BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=数据存储数据存储:LIST MODELIST MODE=数据显示数据显示:直方图直方图(Histogram)Histogram)二维点图二维点图(Dot Plot)Dot Plot)等高线图等高线图(Contour Plot)Contour Plot)密度图密度图(Density)Density)三维图（三维图（3 3D PlotD Plot）等等第14页/共153页BD BiosciencesImmune Function单参数直方图分析单参数直方图分析第15页/共153页BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=直方图分析直方图分析第16页/共153页BD BiosciencesImmune Function多参数散点图分析多参数散点图分析第17页/共153页BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=等高图和密度图分析等高图和密度图分析第18页/共153页BD BiosciencesImmune Function数据分析数据分析=三维图分析三维图分析第19页/共153页BD BiosciencesImmune Function第20页/共153页流式细胞仪的应用流式细胞仪的应用第21页/共153页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的临床应用流式细胞仪的临床应用=HIVHIV免疫分型，免疫分型，CD4CD4绝对计数绝对计数=淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析=白血病和淋巴瘤的免疫分型白血病和淋巴瘤的免疫分型=肿瘤的细胞周期和倍体分析肿瘤的细胞周期和倍体分析=网织红细胞计数网织红细胞计数=细胞移植的免疫状态监测细胞移植的免疫状态监测=干细胞计数干细胞计数=阵发性血红蛋白尿阵发性血红蛋白尿=HLA-B27HLA-B27检查检查=血小板功能及相关疾病血小板功能及相关疾病第22页/共153页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的科研应用流式细胞仪的科研应用=免疫功能研究免疫功能研究=血小板分析（心脑血管疾病）血小板分析（心脑血管疾病）=细胞周期和倍体分析细胞周期和倍体分析=细胞凋亡细胞凋亡=干细胞研究干细胞研究=树突细胞研究树突细胞研究=肿瘤相关基因表达的研究肿瘤相关基因表达的研究=抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究抗肿瘤药物作用机制以及多药耐药性的研究=放疗放疗/化疗疗效的研究化疗疗效的研究第23页/共153页BD BiosciencesImmune Function流式细胞仪的应用（免疫）流式细胞仪的应用（免疫）淋巴细胞免疫分型淋巴细胞免疫分型淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析CD4CD4绝对计数绝对计数HIVHIV与与SARSSARS的诊断与研究的诊断与研究淋巴细胞淋巴细胞CD4/CD8CD4/CD8分析分析CD4CD4绝对计数绝对计数T T细胞活化细胞活化免疫功能和免疫调控的研究免疫功能和免疫调控的研究淋巴细胞和单核细胞的活化淋巴细胞和单核细胞的活化细胞因子的研究细胞因子的研究淋巴细胞的增殖淋巴细胞的增殖树突状细胞的研究树突状细胞的研究第24页/共153页BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色使用经荧光素标记的特异单克隆抗体，进行多色染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗染色，同时分析淋巴细胞膜上多种白细胞分化抗原（原（CDCD分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分分子）的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定性分析开，进行定性分析各淋巴细胞亚群的百分含量各淋巴细胞亚群的百分含量淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析淋巴细胞亚群的绝对计数，进行定量分析第25页/共153页BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据功能，淋巴细胞主要分为根据功能，淋巴细胞主要分为B B淋巴细胞（淋巴细胞（CD19+CD19+），），与体液免疫有关与体液免疫有关T T淋巴细胞（淋巴细胞（CD3+CD3+），），与细胞免疫有关与细胞免疫有关总总T T和总和总B B可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病可以用来判断某些免疫缺陷和自身免疫性疾病 NKNK细胞（细胞（CD3-CD16+56+CD3-CD16+56+），），行使免疫监控功能，行使免疫监控功能，能够能够介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用。

介导对某些肿瘤细胞和病毒感染细胞的细胞毒性作用第26页/共153页BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群分析淋巴细胞亚群分析根据根据CD4CD4、CD8CD8表达，表达，T T淋巴细胞又分为淋巴细胞又分为T T辅助辅助/诱导细胞（诱导细胞（CD3+CD4+CD3+CD4+）T T抑制抑制/细胞毒性细胞（细胞毒性细胞（CD3+CD8+CD3+CD8+）Th/Ts Th/Ts 评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调评价那些自身免疫失调、被怀疑是免疫失调或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态或已知患有免疫缺陷的病人的免疫状态第27页/共153页BD BiosciencesImmune Function诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无诊断原发性免疫缺陷病（如先天性无r球蛋白血症）或继发性球蛋白血症）或继发性免疫缺陷病（如免疫缺陷病（如AIDS）造血干细胞移植后免疫重建（造血干细胞移植后免疫重建（6个月个月NK；9个月个月T、B）Th/TsTh/Ts：机体免疫功能亢进机体免疫功能亢进：自身免疫性疾病，如：自身免疫性疾病，如SLESLE、类风、类风湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）湿性关节炎等（治疗有效恢复正常）Th/TsTh/Ts：机体免疫功能低下机体免疫功能低下：AIDSAIDS、病毒感染、慢性活动性、病毒感染、慢性活动性肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等肝炎和活动性肝硬化、再障、结核、肿瘤等移植后动态免疫监测：移植后动态免疫监测：急排临床症状出现前急排临床症状出现前1-51-5天，活化天，活化T T和和Th/TsTh/Ts持续持续，1.21.2预示急排；预示急排；Th/TsTh/Ts持续持续 表明可能感染，比值表明可能感染，比值1.081.08，可能性大，可能性大，0.20.2应停用免疫抑应停用免疫抑制剂；制剂；实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察实体肿瘤疗效和病人免疫状态观察治疗前常伴治疗前常伴T T 、Th/TsTh/Ts，放，放/化疗有效可恢复；化疗有效可恢复；淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；淋巴细胞免疫表型正常或治疗后能恢复正常者预后常较好；探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）探索疾病发病机理、进程和预后（炎症、肿瘤）临床意义临床意义判断病人的机体免疫状态判断病人的机体免疫状态第28页/共153页BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞亚群双色分析淋巴细胞亚群双色分析12%76%49%26%11%第29页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionAIDS 病人病人T亚群分析亚群分析27-51%15-44%50-84%第30页/共153页BD BiosciencesImmune Function先天性无先天性无 r 球蛋白血症球蛋白血症5-18%第31页/共153页BD BiosciencesImmune Function乳腺癌患者乳腺癌患者T淋巴细胞亚群变化淋巴细胞亚群变化第32页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionTriTEST/MultiTestTriTEST/MultiTest与与T T淋巴细胞绝对计数淋巴细胞绝对计数使用三色试剂或四色免洗试剂使用三色试剂或四色免洗试剂样本使用样本使用EDTAEDTA抗凝全血，用血量抗凝全血，用血量5050uLuL免洗操作，减少细胞丢失免洗操作，减少细胞丢失绝对计数绝对计数TruCOUNTTruCOUNT管预先加有已知数量微球，在流式细管预先加有已知数量微球，在流式细胞仪上直接得到胞仪上直接得到T T淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效淋巴细胞亚群的绝对含量，提高工作效率和计数的精确度率和计数的精确度单平台计数单平台计数报告报告T T淋巴细胞及淋巴细胞及THTH、TSTS百分含量、绝对含量和百分含量、绝对含量和H/SH/S比值比值第33页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionTriTEST CD4/CD8/CD3TriTEST CD4/CD8/CD3分析分析与与T T淋巴细胞绝对计数淋巴细胞绝对计数h%T LymphCD3+Abs CnthCD3+CD4+%T LymphCD3+CD4+Abs CnthCD3+CD8+%T LymphCD3+CD8+Abs CnthT H/S Ratio第34页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionMultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19第35页/共153页淋巴细胞淋巴细胞活化功能研究活化功能研究第36页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionT淋巴细胞活化淋巴细胞活化细胞数目增殖细胞数目增殖细胞表面表达细胞表面表达活化标记活化标记分泌细胞因子分泌细胞因子第37页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionCFSE失踪原理羟基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺脂(CFSE)是一种可穿透细胞膜的荧光染料，CFSE进入细胞后可以不可逆地与细胞内的氨基结合偶联到细胞蛋白质上。

当细胞分裂时，CFsE标记荧光可平均分配至两个子代细胞中，因此其荧光强度是亲代细胞的一半这样，在一个增殖的细胞群中，各连续代细胞的荧光强度呈对递减，利用流式细胞仪在488nm激发光和荧光检测通道可对其进行分析体内、体外实验均可以应用第38页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDilution of CFSE with cell divisionLyons and Parish,1994JIM,171;131Divisions:3 2 1 0CFSEFL-1(Log)Divisions:3 2 1 0第39页/共153页BD BiosciencesImmune Function葡萄球菌肠毒素刺激牛时间变化示意图，第40页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionT淋巴细胞活化淋巴细胞活化细胞数目增殖细胞数目增殖细胞表面表达细胞表面表达活化标记活化标记分泌细胞因子分泌细胞因子第41页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionT细胞激活抗原表达的动力学曲线细胞激活抗原表达的动力学曲线第42页/共153页FastImmune Assay System快速全面检测淋巴细胞功能快速全面检测淋巴细胞功能 第43页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionBDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统快速免疫活化检测系统lymphocyte Activation4hStain15minLyse/Fix15minAcqusitionerythrocytestimulus第44页/共153页BD BiosciencesImmune Function优点优点快速快速全程全程5h简便简便全血分析全血分析（肝素钠抗凝血肝素钠抗凝血）无需分离无需分离PBMCs无需组织培养无需组织培养免洗试剂，无需洗涤离心免洗试剂，无需洗涤离心高效高效多参数分析加速研究进程多参数分析加速研究进程功能活性检测同时报告单个细胞亚型功能活性检测同时报告单个细胞亚型可外延可外延T细胞分析可进行亚群分析细胞分析可进行亚群分析可外延于可外延于B、NK、单核细胞、单核细胞接近生物体接近生物体自身分析条件自身分析条件应用全血保留了细胞与生化微环境应用全血保留了细胞与生化微环境更能代表体内状态更能代表体内状态BDFastImmuneActivationSystem快速免疫活化检测系统快速免疫活化检测系统第45页/共153页BD BiosciencesImmune Function应用实例：应用实例：HIVHIV病例病例T T细胞活化检测细胞活化检测第46页/共153页BD BiosciencesImmune Function淋巴细胞活化功能检测的广泛应用淋巴细胞活化功能检测的广泛应用 结合淋巴细胞亚群分析结合淋巴细胞亚群分析免疫调节免疫调节:病因学研究病因学研究:AIDSAIDS、感染、肿瘤、自身免疫性感染、肿瘤、自身免疫性疾病疾病药物筛选药物筛选/疫苗疗效评价疫苗疗效评价各种状态下免疫状态评价：移植、寄生虫、营各种状态下免疫状态评价：移植、寄生虫、营养失调、创伤、手术、烧伤、放养失调、创伤、手术、烧伤、放/化疗等化疗等第47页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionT细胞的细胞因子分型细胞的细胞因子分型=型介导细胞免疫反应型介导细胞免疫反应=引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、引起迟发过敏反应、巨噬细胞活化、2 2型反应下调型反应下调=刺激来源：病毒、某些细菌刺激来源：病毒、某些细菌=型介导体液免疫反应型介导体液免疫反应=引起引起B B细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、细胞增殖、分泌多克隆免疫球蛋白、1 1型反应下调型反应下调=刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源刺激来源：多细胞寄生虫、过敏源第48页/共153页BD BiosciencesImmune Function活化的淋巴细胞分泌细胞因子活化的淋巴细胞分泌细胞因子第49页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionBDFastImmuneCytokineSystem快速免疫细胞因子检测系统快速免疫细胞因子检测系统 AntiIFNgCD69 Activation37IncubationIntracellularStainLyse/FixAcqusitionPermeabilizelymphocyteerythrocytestimulusSurfaceStainWashcytokineWashWashprotein blocking基于细胞水平的研究基于细胞水平的研究胞内因子胞内因子胞外因子胞外因子第50页/共153页BD BiosciencesImmune Function优点优点快速快速一天内完成，实验流程需6-8小时简便简便全血分析全血分析（肝素钠抗凝血肝素钠抗凝血）无需分离无需分离PBMCs无需组织培养无需组织培养高效高效可在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子可在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚型，也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞亚型，进行多参数相关分析进行多参数相关分析接近生物体接近生物体自身分析条自身分析条件件应用全血保留了细胞与生化微环境应用全血保留了细胞与生化微环境更能代表体内状态更能代表体内状态注意注意质控：用质控：用CD69做刺激和破膜效果的判定做刺激和破膜效果的判定BDFastImmuneCytokineSystem快速免疫细胞因子检测系统快速免疫细胞因子检测系统第51页/共153页BD BiosciencesImmune Function应用实例：分析应用实例：分析1型与型与2型免疫反应型免疫反应第52页/共153页CytometricBeads Array (CBA)系统系统胞外细胞因子检测系统胞外细胞因子检测系统第53页/共153页BD BiosciencesImmune Function简介简介CBA是是一一系系列列荧荧光光强强度度不不同同、包包被被有有捕捕获获抗抗体体的的微微球球，类类似似于于ELISA的的捕捕获获孔孔板板，可可以以捕捕获获相相应应的的抗抗原原，再再结结合合第第二二种种荧荧光光检检测测抗抗体体，形形成成一一种种双双抗抗体体夹夹心心结结构构，能能结结合合上上，就能发出荧光来，从而检测到相应的抗原。

就能发出荧光来，从而检测到相应的抗原简简而而言言之之，将将包包被被有有不不同同抗抗体体的的微微球球混混合合在在一一个个样样本本中中即即可进行多参数检测可进行多参数检测应应用用领领域域：主主要要用用于于血血清清、血血浆浆、培培养养细细胞胞上上清清、眼眼泪泪或或房水等各种液相中可溶性细胞因子的浓度检测房水等各种液相中可溶性细胞因子的浓度检测细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析第54页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionHow to analyze soluble proteins in FCM?+待分析的可溶性抗原待分析的可溶性抗原荧光标记的检测抗体 捕获微球 捕获抗体Bead微球体标记技术微球体标记技术&FCM技技术术基基 本本 原原 理理CBA捕获微球可溶性抗原检测抗体 三明治复合物第55页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionCytometric Bead Array multiplexed beads123不同强度红色荧光的捕获微球，在FCM FL3检测不同的目标蛋白PE 标记的检测抗体，在FCM FL2检测。

荧光强度即为靶蛋白量4756第56页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionHumanTh1/Th2CytokineCBAKitNosampleaddedinDetectorantibodiesonly第57页/共153页BD BiosciencesImmune Function Chemokine-ICBAAssayStandard0 pg/mlCBAAssayStandard第58页/共153页BD BiosciencesImmune Function10 pg/mlCBAAssayStandard cont.cont.Chemokine-ICBAAssayStandard第59页/共153页BD BiosciencesImmune Function20 pg/mlCBAAssayStandard cont.cont.Chemokine-ICBAAssayStandard第60页/共153页BD BiosciencesImmune Function80 pg/mlCBAAssayStandard cont.cont.Chemokine-ICBAAssayStandard第61页/共153页BD BiosciencesImmune Function156 pg/mlCBAAssayStandard cont.cont.Chemokine-ICBAAssayStandard第62页/共153页BD BiosciencesImmune Function312 pg/mlCBAAssayStandard cont.cont.Chemokine-ICBAAssayStandard第63页/共153页BD BiosciencesImmune Function625 pg/mlCBAAssayStandard cont.cont.Chemokine-ICBAAssayStandard第64页/共153页BD BiosciencesImmune Function1250 pg/mlCBAAssayStandard cont.cont.Chemokine-ICBAAssayStandard第65页/共153页BD BiosciencesImmune Function2500 pg/mlCBAAssayStandard cont.cont.Chemokine-ICBAAssayStandard第66页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionHumanTh1/Th2LymphokineCBA 标准曲线标准曲线5000 pg/ml2500 pg/ml1250 pg/ml625 pg/ml312 pg/ml80 pg/ml20 pg/mlIL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-IL-2IL-4IL-5IL-10TNF-IFN-第67页/共153页BD BiosciencesImmune Function操作步骤操作步骤l检测物与捕获微球共检测物与捕获微球共孵育孵育。

l洗涤洗涤l标记标记荧光探测试剂（荧光探测试剂（FITCFITC或或PEPE标记）l洗涤洗涤l流式细胞仪上机流式细胞仪上机检测检测lCBACBA分析软件批量数据分析分析软件批量数据分析第68页/共153页BD BiosciencesImmune Function与传统的与传统的ELISAsELISAs检测相比检测相比能够同时对单一样本进行多种目的蛋白检测能够同时对单一样本进行多种目的蛋白检测较传统检测节省样本量（较传统检测节省样本量（50l）与与ELISAs相比灵敏度高（相比灵敏度高（2.8pg/ml）、重复性好）、重复性好检测的线性范围宽（检测的线性范围宽（0-5000pg/ml）所有分析只需一组标准曲线所有分析只需一组标准曲线避免酶联反应所致人工假象避免酶联反应所致人工假象强大的强大的CBA分析软件分析软件节省操作时间、检测时间和分析时间节省操作时间、检测时间和分析时间第69页/共153页BD BiosciencesImmune Function使用使用Prostate-specificantigen（PSA-3）及其突变体）及其突变体PSA-3A对前列腺癌患者对前列腺癌患者T细胞免疫，通过细胞免疫，通过HumanTh1/Th2CytokineCBAKit检测免疫检测免疫T细胞的细胞因子分泌水平细胞的细胞因子分泌水平A，B，C为稀释标准，为稀释标准，D为无处理对照组，为无处理对照组，E为为PSA-3A处理组，处理组，F为为PSA-3处理组处理组摘自摘自TerasawaH,etal.ClinicalCancerResearch.Vol.8,41-53,January2002上述研究发现上述研究发现PSA-3A比比PSA-3能更有效的杀伤前列腺肿瘤，与能更有效的杀伤前列腺肿瘤，与PSA-3A能刺激能刺激T细胞分泌更高水平细胞分泌更高水平的的IL-2、IL-4、IL-5和和IFN-有关，为后续药物开发打下基础有关，为后续药物开发打下基础第70页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionBD CBA新新产品系列产品系列BD CBA Flex Set-New基本原理与基本原理与CBAKit相似相似检测原理不同：检测原理不同：FlexSet微球种荧光，分别在微球种荧光，分别在流式细胞仪的流式细胞仪的FL3（近红外荧（近红外荧光）和光）和FL4（红色荧光）通道（红色荧光）通道检测，通带有近红外和红色两检测，通带有近红外和红色两过这个二维矩阵（对应于微球过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，上的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白，从而定性目的蛋白，PE标记标记的检测抗体在的检测抗体在FL2通道来对目通道来对目的蛋白定量。

的蛋白定量第71页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionCBAKit与与CBAFlexSetCBAKit同时检测同时检测5或者或者6个个全部试剂全部试剂CBAAnalysisSoftware检测指标组合固定检测指标组合固定CBAFlexSet最多达最多达75个个需另购需另购BufferkitFCAPArraySoftware检测指标可自由组合检测指标可自由组合第72页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionCBA/CBAFlexset的应用领域的应用领域血清、血浆或培养液上清等各种液相中细胞因子的血清、血浆或培养液上清等各种液相中细胞因子的浓度检测浓度检测细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析细胞凋亡等信号传导研究，磷酸化蛋白定量分析免疫细胞功能性研究免疫细胞功能性研究免疫疾病的监控免疫疾病的监控疫苗研发，药效评价，总体免疫功能分析疫苗研发，药效评价，总体免疫功能分析传染性疾病传染性疾病肿瘤研究肿瘤研究第73页/共153页调节性调节性T T细胞细胞研究进展研究进展第74页/共153页BD BiosciencesImmune Function免疫耐受机制免疫耐受机制以往研究认为：（以往研究认为：（“被动被动”方式）方式）胸腺细胞及前胸腺细胞及前B（pre-B）细胞在中枢免疫器官）细胞在中枢免疫器官中的克隆清除中的克隆清除 进入外周的成熟淋巴细胞表达针对自身抗原的识进入外周的成熟淋巴细胞表达针对自身抗原的识别受体被诱导进入免疫无能状态而不表现任何自别受体被诱导进入免疫无能状态而不表现任何自身反应性身反应性 部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视部分淋巴细胞对自身抗原的免疫忽视 第75页/共153页BD BiosciencesImmune Function免疫耐受机制近年研究表明：（“主动”方式）调节性调节性T T（TrTr）细胞以）细胞以“主动主动”的方式维持自身免的方式维持自身免疫耐受疫耐受 这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节这一发现将改变我们对自身免疫耐受及免疫调节机制的认识，并将对免疫学基本理论的发展产生重大机制的认识，并将对免疫学基本理论的发展产生重大影响。

影响第76页/共153页BD BiosciencesImmune Function调节性T细胞的特异性标志 FOXP3（Forkhead box protein P3）是一个50kD的转录因子，也称为Scurfin、JM2、IPEX它是一个主要调节基因CD4+/CD25-细胞上FOXP3的转录表达可以诱导GITR、CD103和CTLA4的表达，并且促使调节性T细胞表型形成FOXP3在X连锁自身免疫过敏失调综合征（XLAAD或IPEX）患者中发生突变FOXP3过度表达会引起机体的免疫应答下降，表明它是一个调节T细胞活性的主要转录因子FOXP3表达于细胞内 第77页/共153页BD BiosciencesImmune Function调节性T细胞分类根据来源、特异性及效应机制可分为天然调节性T细胞和获得性调节性T细胞天然性调节性T细胞：在正常人和小鼠的外周血及脾脏组织的CD4+T细胞中约有510的细胞持续高表达CD25分子，该群细胞从胸腺中发育，组成性表达foxp3，在体内外发挥免疫调节功能获得性调节性T细胞：是由外周T细胞在特定的条件下分化出来，通过分泌高水平的IL-10和 TGF-而发挥其抑制功能而发挥其抑制功能.第78页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionRegulatory T Cells Background:its DevelopmentThymusPeripheryTcellprecursorTr1Th3FoxP3-?iDC and/or in thePresence of IL-10And/or TGFb bConventionalTcellNaveTcellNaturallyoccurringTregcellAdaptiveTregcellCD25GITRCTLA-4FoxP3+CD4CD127CD25GITRCTLA-4FoxP3+CD4CD127FoxP3-第79页/共153页BD BiosciencesImmune Function人Tr细胞表达特征：CD127+nCD127CD127是非二聚体是非二聚体IL-7IL-7受体受体nCD127CD127表达于胸腺细胞，表达于胸腺细胞，T T、B B祖细胞，成熟祖细胞，成熟T T细胞，细胞，单核细胞及其它淋巴细胞和骨髓细胞单核细胞及其它淋巴细胞和骨髓细胞nT T细胞活化后细胞活化后CD127CD127表达下调表达下调nCD127CD127表达下调发生在表达下调发生在TrTr细胞细胞nCD127CD127下调同时下调同时CD25CD25高表达、高表达、FoxP3+FoxP3+为为TrTr细胞细胞nCD127CD127优于传统的优于传统的FoxP3+FoxP3+保证了细胞的活性保证了细胞的活性第80页/共153页BD BiosciencesImmune Function从Human PBMCs中分离Tr细胞第81页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionFoxP3染色确认Tr细胞第82页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionFoxP3染色确认Tr细胞第83页/共153页BD BiosciencesImmune Function小结pCD127CD127弱表达弱表达pFoxP3FoxP3+CD127CD127loloCD25CD25hi-inthi-intpCD127CD127和和FoxP3FoxP3联合应用于联合应用于TrTr细胞的功能性研究（体细胞的功能性研究（体内体外）内体外）第84页/共153页树突状细胞树突状细胞（dendriticcell，DC）第85页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC的生物学特点的生物学特点DC因其具有膜样或树突样突起而得名因其具有膜样或树突样突起而得名DC包括郎罕氏细胞、间隙包括郎罕氏细胞、间隙DC、滤泡、滤泡DC（FDC）、并指）、并指DC（IDC）等等。

其在体内含量甚微，仅占外周血单个核细胞（等等其在体内含量甚微，仅占外周血单个核细胞（PBMC）的）的1以以下，下，但分布非常广泛，但分布非常广泛，在血液、肝、脾、淋巴结及非免疫器官组织中在血液、肝、脾、淋巴结及非免疫器官组织中都有存在都有存在第86页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC的分化和成熟的分化和成熟DC可分为可分为前体前体DC，未成熟未成熟DC，成熟成熟DCDC起源于骨髓起源于骨髓CD34+多能细胞，多能细胞，在在GM-CSF作用下，作用下，进进一步分化一步分化为为DC前体前体细细胞，包括髓系前体和淋巴系前体，并离开骨髓胞，包括髓系前体和淋巴系前体，并离开骨髓进进入外周血入外周血在在外周血中至少有两种外周血中至少有两种DC前体被鉴定出来：前体被鉴定出来：PlasmacytoidDCPDC浆细胞样的树突细胞浆细胞样的树突细胞MyeloidDCMDC髓样的树突细胞髓样的树突细胞血液中的前体血液中的前体DC随血液迁移到随血液迁移到皮肤、胃皮肤、胃肠肠道、心、肝、肺等非淋巴器道、心、肝、肺等非淋巴器官官发发育育为为未成熟未成熟DC未成熟未成熟DC摄取外来抗原后，可自发成熟，由外周向次级淋巴器官归巢摄取外来抗原后，可自发成熟，由外周向次级淋巴器官归巢在成熟过程中，在成熟过程中，DC摄取和加工处理外来抗原的能力逐渐减弱，而递呈摄取和加工处理外来抗原的能力逐渐减弱，而递呈抗原的功能逐渐增强抗原的功能逐渐增强第87页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionAreviewofJacquesBanchereau第88页/共153页BD BiosciencesImmune Function树突状细胞的可塑性树突状细胞的可塑性DC在不同细胞因子和生长因子的作用下可以向着不同的方向分化在不同细胞因子和生长因子的作用下可以向着不同的方向分化DC分化过程中的不同刺激引导它们向多种组织和器官移动，在这些分化过程中的不同刺激引导它们向多种组织和器官移动，在这些组织中担当起对抗入侵感染因素的哨兵组织中担当起对抗入侵感染因素的哨兵第89页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC的生物学功能的生物学功能DC是一类抗原呈递细胞（是一类抗原呈递细胞（APC），在捕获和处理抗原后，将抗原递呈），在捕获和处理抗原后，将抗原递呈给特殊的初始给特殊的初始T淋巴细胞，引发初次免疫反应，在诱导免疫耐受和调淋巴细胞，引发初次免疫反应，在诱导免疫耐受和调控免疫活性方面扮演着重要角色，控免疫活性方面扮演着重要角色，DC是机体内惟一能激活初始是机体内惟一能激活初始T细胞细胞的的APC。

DC还可以通过激活巨噬细胞，还可以通过激活巨噬细胞，NK细胞，细胞，NK样样T细胞和嗜酸性粒细胞细胞和嗜酸性粒细胞引发机体对入侵感染因素的反应，从而连接天然免疫系统和适应性免引发机体对入侵感染因素的反应，从而连接天然免疫系统和适应性免疫系统疫系统DC受细胞因子调控的同时受细胞因子调控的同时,本身也可产生多种细胞因子本身也可产生多种细胞因子,如如IFN-,IL-12,GM-CSF,IL-1,IL-6和和TNF-等等第90页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC将将Ag提呈给初始提呈给初始T细胞细胞第91页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC的表面标志的表面标志人人DC的主要特征性表面标志为的主要特征性表面标志为CD1a和和CD83，CD83还是还是DC充分成熟充分成熟的标志成熟成熟DC高表达高表达CD80（B7-1），），CD86，CD40和和CD54等共刺激分子，等共刺激分子，而未成熟而未成熟DC不表达或低表达这些分子不表达或低表达这些分子未成熟未成熟DC具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体具有强大的内吞作用，并高表达大多数趋化因子受体所有所有DC共同的突出特点是能高水平表达共同的突出特点是能高水平表达MHC-II类分子如类分子如HLA-DR，DC成熟过程突出的标志是成熟过程突出的标志是MHC-II类分子的重分布，从主要在细胞浆类分子的重分布，从主要在细胞浆内转变为主要在细胞膜表面。

内转变为主要在细胞膜表面第92页/共153页BD BiosciencesImmune Function人人DC成熟过程中的特点改变成熟过程中的特点改变IL-10第93页/共153页BD BiosciencesImmune Function人外周血人外周血DC亚群的鉴定亚群的鉴定PDC：linnegCD11cnegCD123high；MDC：linnegCD11chighCD123low 二者还都高表达二者还都高表达MHC-（HLA-DR），但都不表达），但都不表达lin（CD3，CD14，CD16，CD19，CD20，CD56）注：注：CD11c：整合素：整合素x链链 CD123：IL-3受体受体链链第94页/共153页BD BiosciencesImmune Function体外人体外人DC制备制备前体前体DC来源来源外周血单个核细胞外周血单个核细胞/单核细胞单核细胞密度梯度离心密度梯度离心BDIMagCellSeparationSystem骨髓、新生儿脐带血的骨髓、新生儿脐带血的CD34+细胞细胞在细胞因子（如在细胞因子（如GM-CSF，IL-4和TNF-）的作用下诱导）的作用下诱导DC体外分化体外分化第95页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC体外诱导分化体外诱导分化第96页/共153页BD BiosciencesImmune Function监控监控DC成熟度的监控成熟度的监控BDMulticolorMDDCphenotypingreagentCD209(DC-SIGN)：DC独有标志独有标志CD83：充分成熟标志：充分成熟标志CD86：DC成熟过程中表达增加成熟过程中表达增加第97页/共153页BD BiosciencesImmune Function小鼠小鼠DC小鼠小鼠DC的标志是的标志是CD11c，成熟，成熟DC也有也有MHC-和和CD80，CD86的表达的表达小鼠小鼠DC前体主要分为两类：功能上等同于人前体主要分为两类：功能上等同于人MDC和和PDC小鼠小鼠DC制备：小鼠骨髓制备：小鼠骨髓BDIMagMouseDendriticCellEnrichmentSet大鼠大鼠DC：常用标志：常用标志OX62，OX6（MHC-），），CD80，CD86等等第98页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC功能分析功能分析刺激刺激T细胞，诱导其增殖（细胞，诱导其增殖（BrdU溴脱氧尿苷的掺入）和细胞因子的分泌溴脱氧尿苷的掺入）和细胞因子的分泌DC细胞因子的分泌细胞因子的分泌第99页/共153页BD BiosciencesImmune Function树突状细胞分泌的细胞因子树突状细胞分泌的细胞因子DC分泌的细胞分泌的细胞因子有很多种，因子有很多种，但各种细胞因子但各种细胞因子与与DC功能的相功能的相关性尚在探讨中关性尚在探讨中第100页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC临床和科研应用临床和科研应用1肿瘤发生发展机制的探讨肿瘤发生发展机制的探讨DC瘤苗研发瘤苗研发将经肿瘤抗原（如肿瘤抗原多肽、肿瘤细胞或裂解成分、肿瘤和将经肿瘤抗原（如肿瘤抗原多肽、肿瘤细胞或裂解成分、肿瘤和DC融合的杂交细胞、肿瘤特异表达的融合的杂交细胞、肿瘤特异表达的mRNA）在体外冲击致敏的）在体外冲击致敏的DC回输体内，再与自体回输体内，再与自体T细胞共育，有利于打破免疫耐受，有效诱细胞共育，有利于打破免疫耐受，有效诱导导CTL介导的特异性抗肿瘤免疫应答。

介导的特异性抗肿瘤免疫应答已用于黑色素瘤，前列腺癌，肾癌，多发性骨髓瘤，淋巴瘤，肝癌，已用于黑色素瘤，前列腺癌，肾癌，多发性骨髓瘤，淋巴瘤，肝癌，妇科肿瘤，恶性脑神经胶质瘤等的临床治疗实验妇科肿瘤，恶性脑神经胶质瘤等的临床治疗实验病毒感染病毒感染移植物抗宿主反应移植物抗宿主反应过敏和超敏反应过敏和超敏反应自身免疫性疾病自身免疫性疾病第101页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionControlPBMCSSclogCD3,14,19ECDCD4PC7HLADRPC5CD11cFITCCD123PEAscitesLN28%65%75%13%68%24%FScSSclogPDCMDCPDCandMDCinOvarianCancerHealthyControlPBMCSSClogCD3,14,19ECDCD4PC7HLADRPC5CD11cFITCCD123PEPatientAscitesPatientperitoneallymphnode(LN)28%65%75%13%68%24%FSCSSClogPDCMDCPDCandMDCinOvarianCancer(5-color)PDC(red);MDC(blue)Different percentage and ratio of PDC and MDCin 3 samplesMDC role in cancer and cell immunityscatter properties of MDC in 3 samples:larger in ascites and undergoing apoptosis in LN第102页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionDC与与HIVThe Journal of Immunology,2002,168:47964801.PDCMDC-第103页/共153页PhosFlow-Phospho-proteins Detection by Flow Cytometry流式蛋白磷酸化检测流式蛋白磷酸化检测第104页/共153页BD BiosciencesImmune Function细胞间和细胞内的信号调节细胞间和细胞内的信号调节细胞信号细胞信号胞间信号胞间信号 胞内信号胞内信号细胞因子、趋化因子、细胞因子、趋化因子、细胞因子受体、趋化因子受体和生长细胞因子受体、趋化因子受体和生长生长因子等生长因子等 因子受体等的下游信号因子受体等的下游信号第105页/共153页BD BiosciencesImmune Function磷酸化磷酸化/去磷酸化去磷酸化分子调控点分子调控点在细胞的多重信号传导路中，许多蛋白和酶的活性都受控于酪氨酸在细胞的多重信号传导路中，许多蛋白和酶的活性都受控于酪氨酸tyrosine、丝氨酸、丝氨酸serine和苏氨酸和苏氨酸threonine的磷酸化的磷酸化蛋白的磷酸化蛋白的磷酸化/去磷酸化是一个可逆的过程：即在蛋白激酶的催化作去磷酸化是一个可逆的过程：即在蛋白激酶的催化作用下向上述氨基酸位点添加磷酸集团，而在蛋白磷酸酶的水解作用用下向上述氨基酸位点添加磷酸集团，而在蛋白磷酸酶的水解作用下移除磷酸集团下移除磷酸集团磷酸化磷酸化/去磷酸化参与增殖、分化、发育、凋亡、压力反应等的调控去磷酸化参与增殖、分化、发育、凋亡、压力反应等的调控异常调控见于：如糖尿病（异常调控见于：如糖尿病（II型，胰岛素受体型，胰岛素受体Ser/Thr磷酸化）、炎磷酸化）、炎症（症（P38Kinase）、血管新生（）、血管新生（Tie-2受体和受体和VEGF受体受体Tyr磷酸化）、磷酸化）、肿瘤、心血管疾病、高血压、中风、神经系统疾病等肿瘤、心血管疾病、高血压、中风、神经系统疾病等Protein KinasesProtein PhosphatasesATPADPH20PiPPKinase CascadeGrowth factorCellular ResponsesMediate growth,differentiation and developmentPi第106页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionJAK/STATSignalingPathway:STATPhosphorylationandTranslocationJAK3JAK3NUCLEUSPPIL-4STAT6STAT6STAT6PSTAT6PSTAT6PSTAT6PPPPPIL-4R细胞膜细胞膜膜外膜外膜内膜内第107页/共153页BD BiosciencesImmune Function磷酸化蛋白的检测磷酸化蛋白的检测Method:Immunohistochemistry（免疫组化）（免疫组化）WesternblotFlow cytometry BD PhosFlowCells:IntracellularstainingofphosphorylatedproteinsIncombinationwithsurfacemarkersUsing Phospho-Specific antibody第108页/共153页BD BiosciencesImmune FunctionPPYYYYNon。