郜刚分子生物学-03-染色体-3半不连续复制幻灯片.ppt

2.4 DNA复制的分子机制82.4 原核生物DNA复制的特点（兼顾复制的分子机制）1、DNA的复制基本过程（大肠杆菌为例）• 双链的解开 • RNA引物的合成 • DNA链的延伸 • 切除RNA引物 • 填补缺口 • 连接相邻的DNA片段OriC in E. coli chromosomal DNA♦ 四个9bp的重复序列dnaA结合位点♦ 三个13bp的重复序列若干GATC位点DNA复制的过程-1：双链解开DNA复制的过程-2： 引发体形成DnaB蛋白活化引物合 成酶，引发RNA引物 的合成引发酶完成 这个任务 引物长度约为几个至 10个核苷酸引发酶是一个特殊的RNA聚 合酶，这个现象叫转录激活DNA复制的过程-2：链延伸• 复制的终止比较简单，当复制叉遇到DNA 序列上重复出现的终止序列时，DNA复制的过程-4： 终止切除RNA引物，填补缺口，连接相邻的DNA片段（复制终止）在DNA聚合酶Ⅰ催化下切除RNA引物；留下的空隙由DNA聚合酶Ⅰ催化合成一段DNA填补上；在DNA连接酶作用下，连接相邻的DNA链复制的终止的实现• a、终止序列E.coli 有两个终止区域， 分别结合专一性的终止蛋白序列一：terE terD terA序列二：terF terB terC每个区域只对一个方向的复制叉起作用 • b、专一性终止蛋白E.coli 中由 tus gene 编码通过抑制DNA螺旋酶而发挥终止作用思考：一个问题？• 在复制叉上DNA聚合酶分子要负责两条模板 链的复制，虽然新生链的生长方向只能是 5’-----3’，但是两条模板链的方向又是 相反的，所以新生链的合成方向也是相反 的。

如果酶分子沿着一条模板链向前进， 那么另一条模板链上的复制就无法进行， 但是体内观察发现两条链上的复制几乎是 同时进行的，这个问题是怎么解决的？推测：• 两个酶分子？ • NO！ • 复制叉上根本容纳不了两个酶分子• 两个活性中心？ • YES冈崎的发现• OKAZAKI•3H标记复制中的DNA• DNA复制过程中总是存在一条长的新生链 • 还存在一些短的小片段DNA单链，而且这 些小片段DNA单链在DNA连接酶的作用下 能够转化为成熟的DNA链 • 小片段长度约在1000-2000bp推断• 1、DNA复制过程中两条链不是同时合成的 ，存在一定的时间差 • 2、一条链先合成是连续的，称为前导链； 另一条链是不连续的，称为后随链 • 3、一个酶分子同时完成前导链和后随链的 复制，说明这个酶分子有两个活性中心， 一个活性中心复制前导链的合成，另一个 活性中心负责后随链的合成DNA聚合酶的结构特点：双组分不对称核 心 酶合成先导链合成后随链两个核心酶各负 责合成一条链αεθταεθτδγψ χδ3维持二聚体β夹子β夹子安装复合体 聚合活性3’-5’外切活性激活θ夹住DNA前进ββββDNA聚合酶的组装过程αεθταεθτββδγψ χδ3双组分的不对称结构1 夹子安装机把beida 夹子结合在DNA上， 随后解离2由αεθ组成的核心酶 安装上来3核心酶通过τ亚基连接 起来ββ链延伸过程中的酶DnaBαεθταεθτδγψ χδ3ββ维持二聚体聚合活性DnaG引发酶 引发一段引物ββ5’后随链先导链DNA聚合酶的双组分 不对称结构保证了先导 链的连续复制和后随链 的不连续复制，结果两 条链可以在各自的模板 上同时前进DnaBαεθταεθτββ5’ DnaGDnaBαεθ5’当先导链复制出大约一个冈崎片段长度， 在后随链上暴露出第一个引物结合位点， 引发酶引发一段引物，夹子安装机就将β 夹子结合上来，继而核心酶结合，形成全酶， 后随链的α亚基利用这段引物合成第一个 冈崎片段。

由于先导链上的合成一直在持续， 复制叉前端还在解链，于是新解开的后随链 模板就形成了一个loop结构随着loop的形成，后随链上的核心 酶解离，释放出已经合成的冈崎片 段，并且在复制叉前端暴露出了下 一个冈崎片段的引物，于是β 夹子结合上来，继而核心酶结合， 形成全酶，完成下一个冈崎片段的 复制如此重复直至终 止半不连续复制模型： 这个模型认为，由于两条新生链的生长方向是 相反的，所以先导链和后随链不是同时进行的 先导链的复制先开始而且是连续的，当先导 链复制出一定长度之后，后随链才开始复制， 而且是不连续的只有当前一个冈崎片段复制 完成，暴露出下一个冈崎片段的引物引发位点 之后，才进行下一个冈崎片段的复制请看下图 ：半不连续复制模型先导链前进方向后随链前进方向问题：1，2• 后随链在DNA聚合酶III上形成了一个回折，从而使后随链 与聚合酶的活性位点的结合方向与前导链一致，从而保证 了两条链能够使用同一个全酶进行同一方向的复制更加详细的机制以后讲总 结DNA聚合酶Ⅲ催化先导链和后随链同时合成当先导链复制出大约一个冈崎片段长度，在后随 链上暴露出第一个引物结合位点，引发酶引发一 段引物，夹子安装机就将β夹子结合上来，继而核 心酶结合，形成全酶，并且后随链在酶分 子上拆绕了180°，后随链的α亚基利用这 段引物合成第一个冈崎片段。

由于先导链 上的合成一直在持续，复制叉前端还在解 链，于是新解开的后随链模板就形成了一 个loop结构随着loop的形成，后随链上的核心酶解离，释放出已经 合成的冈崎片段，并且在复制叉前端暴露出了下一个冈 崎片段的引物，于是β夹子结合上来，继而核心酶结合， 形成全酶，完成下一个冈崎片段的复制如此重复直至终止滞后链的延长:DNA pol Ⅲ全酶二聚体的另一亚基与形成一个环的滞后链的模板结合 发挥催化作用 由于模板形成环, 酶向前移动时, 滞后链合成片段也沿 5′→3′方向生长, 与酶催化方向一致 滞后链片段合成接近前方滞后链片 段5′末端时, 模板被释放, 环消失继续重复, 连续进行2.4.3 复制的调控许多现象表明，DNA的复制是受到调控的 比如原核细胞在不同的生长条件下细胞的分裂 速度是不同的， 举个例子： 大肠杆菌细胞在37℃碳源充足的时候，分裂一 次需要46分钟；而在碳源不充足的时候，分裂 一次需要10个小时，但是在两种情况下，DNA 复制的速度都是40分钟左右而且原核细胞的DNA复制的调控和真核细胞的 DNA复制的调控是不同的原核生物DNA复制调控的可能机制1、DNA复制的调控，可能涉及到许多的专一 性蛋白质因子和至少一类RNA分子。

2、细胞中蛋白质和DNA总数的比例可能也是 一个很重要的因素，因为氨基酸饥俄不但造成 蛋白质合成的抑制，而且也造成DNA复制起始 的抑制，然而又不知为什么能够允许正在复制 中的DNA的复制完毕 3、从复制原点起始一轮DNA复制，特异性蛋 白质因子能否识别和结合原点是关键的一步4、在一个细胞周期中，复制原点只能被使用 一次，而不是多于一次比如：SV40复制原 点上结合的大T抗原四聚体起初是没有磷酸化 的；复制起始以后，大T抗原就被磷酸化从而 离开了复制原点这也同样保证了复制原点的 一次性使用 5、DNA被修饰(如甲基化和去甲基化等)，或 者是特异性蛋白质因子被修饰(磷酸化和去磷 酸化等)会影响到DNA复制的进行例子1：大肠杆菌的复制调控例子2：质粒Col 1的复制调控 负调控因子Rop蛋白和反义RNA共同控制了 复制起始所必须的RNA引物的合成，从而来 控制DNA复制的起始 真核细胞DNA复制的调控1、细胞周期水平的调控 又称为限制点调控，即决定细胞停留在分裂期 还是中间期，其中许多因素参与：促细胞分裂 剂、致癌剂等 2、染色体水平的复制调控 与染色体是否处于活化状态有关 3、复制子水平的调控 往往通过复制起始点的保守序列• 在细胞分裂结束后，真核生物细胞核中又一种复 制起始必须的因子licensing factor ，它是激活 状态的，为下一次复制提供起始信号， 在一次复 制完成后，核内的licensing factor失活，同时细 胞质中合成新的licensing factor，但是它不能直 接进入到细胞核内， 当细胞完成一次分离随着 核膜的裂解，licensing factor才有机会与核物质 一起进入核，并且是均等的分配到两个子细胞的 细胞核中，一旦进入细胞核，licensing factor就 会活化，又为下一次复制提供起始信号。

• 补充一种新的调控模式：（4）细菌 (E.coli)DNA每 个细胞周期复 制一次可能受 OriC甲基化的 控制转座子 不讲 以后再讲练练 习习 题题 一一1、DNA复制时，下列哪一种酶是不需要的？ A DNA指导下的DNA聚合酶B DNA连接酶C 拓扑异构酶D 解链酶E 限制性内切酶√2、合成DNA的原料是 A dNMAB dNDPC dNTPD NTPE NMP3、真核细胞进行DNA复制的部位是 A 细胞膜B 细胞浆C 细胞核D 核蛋白体E 微粒体 原核细胞进行DNA复制的部位是其拟核区 A 由DNA为模板合成的DNA片段B 由DNA为模板合成的RNA片段C 由RNA为模板合成的DNA片段D 由RNA为模板合成的RNA片段 4、DNA复制中的引物是 A 5’-TCTA-3’B 5’-ATCT-3’C 5’-UCUA-3’D 5’-GCGA-3’E 3’-TCTA-5’ 5、DNA复制时，模板序列 5’-TAGA-3’将合成哪种互补序列？ 6、关于DNA复制中DNA聚合酶的错误说法是 A 底物是dNTPB 必须有DNA模板C 合成方向是5’ 3’D 需要Mg2+参与E 需要ATP参与7、下列关于大肠杆菌DNA聚合酶的叙述哪一项是正确的 A 具有3’ 5’外切酶活性B 不需要引物C 需要四种不同的三磷酸核苷D dUTP是它的一种作用底物E 可以将两个DNA片段连接起来 8、DNA连接酶： A 使DNA形成超螺旋B 使DNA链 上切口的两个末端连接起来C 合成引物D 将双螺旋解链E 去除引物，填补空缺 9、DNA复制需要 (1) helicase，(2) primase，(3) DNA polymerase，(4) DNA topoisomerase，(5) DNA ligase。

其作用顺序是： A (1) (5) (2) (4) (3)B (1) (2) (3) (4) (5)C (1) (2) (4) (3) (5)D (2) (1) (3) (4) (5)E (3) (1) (4) (5) (2)F (4) (1) (2) (3) (5)10、Okazaki 片段是 A DNA模板上的DNA片段B 引物酶催化合成的RNA片段C 随从链上合成的DNA片段D 领头链上合成的DNA片段11、DNA复制时，子链的合成方向是 A 一条子链 5’ 3’，另一条子链 3’ 5’B 两条子链均为 5’ 3’C 两条子链均为 3’ 5’D 两条子链方向相反12、关于DNA聚合酶I正确的说法是A 有5’-3’核酸外切酶活性B 与DNA聚合活性相结合形成切口平移反应C 可以用于补平缺口D 是延伸所需要的主要酶13、DNA复制的特点是A 半保留性B 需合成RNA引物C 形成复制叉D 半不连续性E 形成Okazaki 片段F 多点复制G 双向复制14、DNA复制时，连续合成的链为 ， 先导链而不连续合成的链为 。

后随链dNTP16、DNA复制时，子链DNA合成的方向为 5’ 3’17、DNA复制时，亲代模板链与子代合成链之间碱基配对的原则是：A与 配对，C与 配。